明日葉對過度訓練致大鼠胃腸功能紊亂影響的研究

劉海燕，張建偉（.華北理工大學公共衛生學院，河北唐山063000；.唐山師范學院體育系，河北唐山063000）

明日葉對過度訓練致大鼠胃腸功能紊亂影響的研究

劉海燕1，張建偉2
（1.華北理工大學公共衛生學院，河北唐山063000；2.唐山師范學院體育系，河北唐山063000）

研究明日葉對過度訓練致大鼠胃腸功能紊亂的作用。建立雄性大鼠過度訓練模型，觀察過度訓練組、補充明日葉組的大鼠腸道主要菌群雙歧桿菌、大腸桿菌數量，腸道代謝產物脲酶、β-半乳糖苷酶活性和主要SCFA含量，以及血漿內毒素、組織勻漿SIgA含量的變化。與正常對照組比較，過度訓練組雙歧桿菌數量及B/E比值顯著升高，大腸桿菌數量顯著降低；β-半乳糖苷酶活性及主要SCFA乙酸、丁酸含量顯著降低，脲酶活性顯著升高；組織勻漿SIgA含量顯著下降，而血漿內毒素含量顯著升高。補充明日葉組各指標與對照組比較均無顯著差異。結果表明，明日葉能夠從腸道菌群、腸道代謝產物及腸道屏障等幾個方面對腸道微生態進行綜合調理，促進腸道健康。

明日葉；過度訓練；運動型胃腸綜合癥；腸道微生態

明日葉為多年生草本，芹科植物，原產地為日本八丈島。從日本的江戶時代開始，當地居民就有明日葉的食用歷史，并認識到了它的藥用價值。近年來，研究發現明日葉里富含多種有益成分，包括11種維生素、13種礦物質、葉綠素、酶、胡蘿卜素、鍺、皂角苷、蛋白質、植物纖維、醣苷、香豆素，還有一類十分罕見的化合物查爾酮[1]。最新研究表明，明日葉有很多有利于健康的功效，如能促進免疫系統功能，改善胃腸道健康，治療肩膀疼痛等肌肉方面疾病，緩解長期疲勞及各種慢性疾病等。明日葉集抗氧化、抗感染、抗微生物、抗腫瘤等功效于一身，可以說是一種超級食品[2]。

在大強度的運動訓練及比賽中，運動員經常會出現腹瀉、腹痛、嘔吐、惡心、吐酸水等胃腸癥狀，運動醫學中將這種運動員在運動中及運動后引起的各種胃腸道癥狀，總稱為運動性胃腸綜合征[3]。在運動中，尤其是一些力竭性的耐力運動項目中，胃腸綜合征的發生率更高為20%～50%[4]。其影響因素有：運動形式、持續時間、運動強度、年齡、性別、訓練狀態、飲食情況等[4]。其中運動強度是引起胃腸綜合征的主要因素。在探究該病癥的形成原因時，過去人們一直把目光集中在運動員是否吃了不干凈的食物。而近來，研究人員發現大強度的運動使運動員腸道微生態發生變化。胃腸道微生態失調是引發運動性胃腸綜合征的一種綜合病因[5]。

運動員要提高訓練水平，保證在比賽中創造優良的成績，需要具備的先決條件就是強健的體魄，能承受大負荷的訓練。因此，健康運動員腸道微生態是不能忽視的環節，而且，對于運動性胃腸綜合征的治療原則，必須采取綜合措施，把重點放在恢復腸道微生態平衡上，通過改善腸道微生態達到預防和治療運動性胃腸綜合癥的目的[6-8]，在保障運動員身體健康的前提下提高運動能力[4]。

明日葉有極強的改善胃腸健康的作用，但是很少見到將其用于運動性胃腸綜合癥的科學實驗研究。為此，我們探討利用天然植物明日葉來調節腸道微生態平衡，減少運動性胃腸綜合征的發生，為其廣泛應用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮明日葉：山東明日葉莊園；蛋白胨、BBL瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基、異丙醇、醋酸鈉、無水乙醇、冰乙酸、丙酸、丁酸、α-甲基戊酸、磷酸等分析純：北京化學試劑公司；對-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷、血清睪酮、血清皮質酮測定試劑盒：Sigma公司；顯色基質鱟試劑盒：廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；組織勻漿ELISA試劑盒（SIgA）：美國R&D公司。

1.2儀器與設備

DL-CJ超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器公司；BS-2F恒溫搖床：常州冠華儀器制造有限公司；5427R高速離心機：Ependorff公司；970CR熒光分光光度計：上海分析儀器廠；UVIKON XL-172紫外-可見光分光光度計：法國SECOMAM公司；GC-2014 SHIMADZU全套氣相色譜儀：日本島津。

1.3方法

1.3.1模型制備、分組及運動訓練方案

雄性SD大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），6周齡，體重（180±18.8）g。普通飼料喂養1周后，隨機分為正常對照組、過度訓練組和明日葉組，每組10只大鼠。依據顧明建立的大鼠跑臺過度訓練模型建立本研究的模型[9]。

對照組：不進行任何訓練，每天補充同劑量的生理鹽水。

過度訓練組：進行持續性大運動量跑臺訓練10周，跑臺坡度為1°。第1周每天適應性訓練10 m/min× 30 min。第2至10周為正式訓練，周日休息，每次從15m/min開始，每5min速度增加5 m/min，直至40 m/min，保持此強度至力竭，并記錄每只大鼠運動到力竭的總時間，計算平均值。在訓練過程中動態觀察大鼠精神狀態、飲食、睡眠等情況。力竭標準：當大鼠不能維持跑臺的預定速度，隨轉動皮帶拖至跑臺后端的擋板處停留達30 s以上，毛刷驅趕或手輕推均無效，視為力竭[10]。

明日葉組：訓練方法同過度訓練組，訓練時間為過度訓練組的平均值。在每次訓練前3、1 h分別灌服用生理鹽水等體積新鮮配制的明日葉鮮榨汁溶液，補充劑量為3 mL/kg體重。

1.3.2樣品制備

動物末次運動訓練后，取大鼠新鮮糞便；之后，禁食12 h，取大鼠尾部血液，2 mL血液于帶有肝素抗凝管的無菌密閉試管，分離得血漿，另4 mL血液離心分離得血清，備用；取血后，脫頸處死取大鼠回腸，迅速用錫紙包裹投入液氮冷凍，-80℃保存，備用。

1.3.3指標測定

腸道微生物測定：平板培養雙歧桿菌、大腸桿菌，并計算B/E（雙歧桿菌/大腸桿菌）比值。各組分別取每只大鼠的新鮮糞便樣品0.5 g，于裝有玻璃珠和50 mL 0.1%蛋白胨稀釋液的滅菌三角瓶內，劇烈震蕩直至糞便樣品混勻。將糞便樣品進行梯度稀釋，分別放入滅菌的裝有9 mL 0.1%蛋白胨稀釋液的厭氧管內。取適當稀釋的糞便樣品各50μL分別加入倒好的BBL瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體平板培養基中，均勻涂布，培養24 h，分別進行平板計數，并計算B/E比值。

腸道代謝產物測定：β-半乳糖苷酶，脲酶，SCFA（短鏈脂肪酸）。取大鼠糞便0.2 g，于2 mL無菌ddH2O水中，震蕩混勻，室溫過夜。而后，劇烈震蕩至完全分散成勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清進行酶活測定及SCFA測定。脲酶活性測定按照Malin的方法[11]，β-半乳糖苷酶活性測定按照Yamany的方法[12]。

糞便SCFA含量測定：用色譜法測定[13]。

血漿內毒素測定：血液樣品制備、細菌內毒素標準溶液配制、鱟試劑、顯色基質及偶氮化試劑等的溶解按照試劑盒步驟進行。內毒素標準溶液配制見表1，內毒素標準曲線見圖1。

SIgA測定：取回腸樣品稱重100 mg，移入勻漿管中；取預冷的生理鹽水于勻漿管中，生理鹽水的體積為組織塊重量的9倍；充分研碎，組織勻漿化得10%勻漿；將制備好的10%勻漿于4℃下4 000 r/min離心20 min；取適量上清液，按照SIgA測定的ELISA試劑盒測定SIgA含量。

表1　內毒素標準溶液配制Table 1　Preparation of endotoxin standard solution

圖1　內毒素標準曲線Fig.1　The standard curve of endotoxin

血清睪酮、血清皮質酮測定：血清睪酮含量采用放射免疫法測定。血清皮質酮含量采用ELISA測定。以上都嚴格按照試劑盒說明操作，并計算血清睪酮/血清皮質酮（T/C）比值。

1.4數據分析

采用SPSS12.0軟件進行分析，Student’s t檢驗。P＜0.05，表示差異有統計學意義。

2　結果與分析

2.1實驗大鼠一般表現

在整個實驗過程中，對照組大鼠體毛有光澤，較為活潑。過度訓練組大鼠毛發稀疏且蓬亂無光澤，精神委靡，嗜睡。第五周時，補充明日葉組大鼠體毛比較潔凈，精神狀態較好，活潑。明日葉組大鼠的表現較過度訓練組大鼠明顯改善，說明明日葉可以起到改善過度疲勞的作用。

2.2糞便微生物的變化

腸道菌群是機體的“第二指紋”，菌群的變化直接反映機體的健康狀況[14]。其中，雙歧桿菌是腸道中普遍存在的對健康有重要作用的菌群。大腸桿菌作為條件致病菌，在機體抵抗力下降時含量增多，被認為是評價腸道菌群狀態的一個重要指標[15]。在很多與腸道相關疾病的研究中，通常將雙歧桿菌、大腸桿菌及雙歧桿菌與大腸桿菌數量的比值，即B/E比值作為重要指標進行測定[16]。

糞便微生物變化見表2。

表2　糞便微生物變化Table 2　The changes of fecalflora

如表2所示，與對照組比較，過度訓練組的雙歧桿菌數量顯著降低，大腸桿菌數量顯著升高，B/E比值顯著降低（P<0.05），說明腸道主要菌群數量失衡；而明日葉組與對照組相比雙歧桿菌數量、大腸桿菌數量以及B/E比值沒有明顯變化，與過度訓練組比較，明日葉組雙歧桿菌數量和B/E比值顯著升高（P<0.05），大腸桿菌數量顯著降低（P<0.05），說明明日葉有改善腸道菌群的作用。

2.3糞便酶活變化

腸道菌群所產酶活性高低直接反映腸道健康[17-18]，這一研究成果早已被人們所認同。其中，β-半乳糖苷酶對腸道健康有重要促進作用，酶活性過低會阻礙碳水化合物的吸收代謝，引起腸道潰瘍性疾病[4，19]。尿素是哺乳動物產生的主要的含氮廢物。脲酶能催化尿素水解為無機氨和二氧化碳。脲酶和無機氨過多會造成腸腔中致病菌增多，損壞黏膜組織[19]。腸道菌群的變化必然引起酶活性的變化。

各組大鼠糞便酶活變化見圖2。

由圖2可知，與對照組相比，過度訓練組大鼠糞便β-半乳糖苷酶活性顯著降低（P<0.01），脲酶活性顯著升高（P<0.05），說明腸道黏膜很可能受損；明日葉組兩種酶活性與對照組比較沒有顯著差異，而與過度訓練組比較β-半乳糖苷酶活性顯著升高（P<0.05），脲酶活性顯著降低（P<0.05），結合表2的結果，說明明日葉的補充使腸道雙歧桿菌數量增加，腸道有益菌的增加又提高了β-半乳糖苷酶的活性，降低了脲酶活性，從而保護了腸道黏膜。本實驗也進一步證實了前人有關腸道菌群與酶活關系的研究。

2.4糞便SCFA變化

機體內腸道優勢菌群是厭氧菌，包括雙歧桿菌、乳酸菌等。這些厭氧菌在適宜底物存在時能發酵底物產生短鏈脂肪酸（SCFA），其中的乙酸、丙酸和丁酸含量最高，是腸道中主要的SCFA[20]。SCFA對腸道健康的促進作用有降低糞便pH值，減少糞便的細胞毒作用，增加膽酸經糞便排泄，減少直腸細胞增生，預防結腸癌等。

圖2　各組大鼠糞便酶活變化Fig.2　The changes of fecalenzyme activities ofrats

糞便短鏈脂肪酸變化見表3。

表3　糞便短鏈脂肪酸變化Table 3　The changes of fecal SCFAs

表3顯示，與對照組比較，過度訓練組大鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量顯著降低（P<0.05），推測正是因為過度訓練組的腸道有益菌數量減少所致；明日葉組大鼠乙酸、丁酸含量與對照組相比沒有顯著差異，而與過度訓練組比較，明日葉組的乙酸、丙酸、丁酸含量都顯著增加（P<0.05），結合表2的結果，提示明日葉的補充通過增加腸道中雙歧桿菌、提高B/E比值而增加了SCFA的含量，進而促進了腸道健康。

2.5SIgA及血漿內毒素含量變化（μmol/g）

人和動物體內都存在著粘膜免疫系統，是機體抗感染的第一道防線。粘膜表面與外界抗原直接接觸，SIgA位于腸粘膜表面粘液中[21]。SIgA缺陷或者不足可改變小腸絨毛及腸壁結構，引起吸收不良等癥狀。腹瀉等腸道疾病患者SIgA含量通常低。內毒素主要成份是脂多糖（LPS），細菌在生活狀態不釋放內毒素，只有當細菌死亡引起自溶或粘附在其他細胞時才表現出毒性。當腸道屏障受損時，即使是黏膜通透性發生輕微增加，LPS也可通過腸黏膜屏障，導致血漿內毒素升高，甚至形成內毒素血癥[22]。所以通常將SIgA和血漿內毒素作為腸道屏障功能的重要評價指標。

各組大鼠SIgA含量見圖3。

圖3　各組大鼠SIgA含量Fig.3　Concentration of SIgA

由圖3可知，與對照組比較，過度訓練組大鼠組織勻漿SIgA含量顯著降低（P<0.05）；明日葉組大鼠組織勻漿SIgA含量與對照組比較沒有顯著差異，而與過度訓練組比較，明日葉組大鼠組織勻漿SIgA含量顯著升高（P<0.05）。血漿內毒素濃度變化見表4。

表4　血漿內毒素濃度變化Table 4　Levelof plasma endotoxins

由表4可知，與對照組比較，過度訓練組大鼠血漿內毒素含量顯著升高（P<0.05）；明日葉組大鼠血漿內毒素與對照組比較含量沒有顯著變化，而與過度訓練組比較，明日葉組大鼠血漿內毒素含量顯著降低（P< 0.05）。以上結果說明補充明日葉可以通過增加SIgA的含量改善了腸道粘膜屏障功能，減少內毒素透過腸道屏障。

2.6血清睪酮及血清皮質酮變化

目前對于過度訓練的診斷還沒有統一的單項指標，一般采用多指標綜合判斷。因此，本研究也采用多指標綜合診斷的方法。血清睪酮、血清皮質酮是判斷過度訓練模型成功建立與否的重要指標[23-24]。

血清睪酮、血清皮質酮濃度變化見表5。

表5　血清睪酮、血清皮質酮濃度變化Table 5　Levelof tserum corticosterone，estosterone and the ratio of T/C

表5顯示，與對照組相比，過度訓練組血清皮質酮含量顯著升高（P<0.05），血清睪酮含量及T/C比值都顯著下降（P<0.05），結合過度訓練組大鼠的表現，如明顯的食欲不振、睡眠障礙、不能維持跑臺的預定速度、隨轉動皮帶拖至跑臺后端的擋板處停留達30 s以上，而且毛刷驅趕或手輕推均無效，說明大鼠過度訓練模型的建立是成功的；明日葉組大鼠各指標沒有顯著變化，而與過度訓練組比較，明日葉組大鼠血清皮質酮含量顯著降低（P<0.05），血清睪酮含量及T/C比值顯著升高（P<0.05），說明明日葉的補充降低了大鼠的疲勞程度，與各組大鼠的一般表現相一致。

3　結論

本實驗結果表明，明日葉能夠顯著增加大鼠腸道有益菌，減少有害菌，改善糞便酶活，增加糞便短鏈脂肪酸的含量，增加SIgA含量并降低血漿內毒素含量，從而達到對腸道菌群、腸道代謝產物及腸道屏障等腸道微生態的綜合調理，以起到改善運動性胃腸綜合癥的作用。

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Study of the Effect of Ashitaba on Gastrointestinal Disorders Induced by Overtraining Rat

LIU Hai-yan1，ZHANG Jian-wei2
（1.SchoolofPublic Health，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，Hebei，China；2.Departmentof PhysicalEducation，Tangshan Normal University，Tangshan 063000，Hebei，China）

The effect of Ashitaba on gastrointestinal disorders induced by overtraining rat was studied.Male overtraining rats were used as research rats.For exercise，overtraining and Ashitaba supplement，the changes in the numbers of Bifidobacterium and E.coli，the activity ofβ-galactosidase and urease，the content of SCFA，SIgA and plasma endotoxin were measured.Compared with normal control group，in overtraining group，the number of Bifidobacterium and the ratio of B/E were significantincreased，the number of E.coli was decreased. The activity ofβ-galactosidase and the levels of acetic acid and butyric acid were remarkably lower in overtraining group，in contrast，the activity of urease was higher.The content of SIgA of overtraining groupwas notably falling，on the contrary，the level ofplasma endotoxin was rising.For the study，ashitaba has a good ability to improve intestinal microecology，such as intestinal flora，intestinal metabolites and intestinal barrier，to promote guthealth with a comprehensive and integrated effect.

Ashitaba；overtraining；sports gastrointestinalsyndrome；intestinalmicroecology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.040

河北省教育廳項目（ZD2015122）；唐山市應用基礎研究計劃項目（14130254B）；2014省級大學生創新創業訓練計劃項目（201410081087）

劉海燕（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：功能性食品的開發利用。

2015-10-09