外源性硫化氫通過抑制JAK/STAT通路對抗高糖引起的人臍靜脈內皮細胞損傷*

林佳瓊， 陳景福， 廖靜秋， 林 凱， 鄧海鷗， 吳冬波， 吳 文△

(1南方醫科大學，廣東廣州510515;2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東省老年醫學研究所東病區內分泌科，廣東廣州510080;3中山大學附屬第一醫院黃埔院區心內科，廣東廣州510700;4南方醫科大學附屬柳州醫院內分泌科，廣西柳州545007)

外源性硫化氫通過抑制JAK/STAT通路對抗高糖引起的人臍靜脈內皮細胞損傷*

林佳瓊1，2， 陳景福3， 廖靜秋1，2， 林 凱2， 鄧海鷗2， 吳冬波4， 吳 文2△

(1南方醫科大學，廣東廣州510515;2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東省老年醫學研究所東病區內分泌科，廣東廣州510080;3中山大學附屬第一醫院黃埔院區心內科，廣東廣州510700;4南方醫科大學附屬柳州醫院內分泌科，廣西柳州545007)

目的:研究外源性硫化氫(H2S)能否通過調控Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子(JAK/STAT)通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷。方法:Western blot法測定JAK2、STAT3、cleaved caspase-3的蛋白水平;CCK-8法檢測細胞存活率;羅丹明123染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(MMP);雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法測定胞內活性氧(ROS)水平;超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒檢測SOD活性。結果:應用400 μmol/L硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預處理HUVECs 30 min能明顯地抑制高糖(40 mmol/L葡萄糖，HG)對p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的上調作用。400 μmol/L NaHS預處理30 min或20 μmol/L JAK/STAT通路抑制劑AG490預處理30 min均能抑制高糖對HUVECs引起的損傷，使細胞存活率和SOD活性升高，cleaved caspase-3蛋白水平、ROS生成量及MMP丟失均減少。結論:外源性的H2S通過抑制JAK/STAT通路保護HUVECs對抗高糖引起的損傷。

硫化氫;JAK/STAT通路;高糖;人臍靜脈內皮細胞

長期以來，硫化氫(hydrogen dulfide，H2S)被認為是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體。目前認為，哺乳動物體內如心血管系統能生成內源性H2S，它是一種新型氣體信號分子，在多種心血管疾病中發揮重要的保護作用。用心肌梗塞的大鼠模型，Wangle等［1］證實 H2S能減輕心室功能障礙。近年，我們［2-3］和其他學者［4-5］證實，外源性的H2S能保護心肌細胞對抗高糖或化學性缺氧引起的損傷，其作用機制與調控核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等通路有關［2-4］。此外，外源性的H2S能夠抑制高糖引起的血管內皮細胞功能失調［6］。

高血糖是導致糖尿病血管內皮功能異常及血管病變的重要啟動因子之一［7］。高糖等可通過激活NF-κB［8］等信號通路損傷血管內皮細胞。Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路是細胞信號轉導的重要通路之一，參與高糖對腎小球濾過膜細胞的損傷［9］。最近，我們證實，JAK/ STAT通路介導高糖引起人臍靜脈內皮細胞HUVECs的多種損傷［10］。值得注意的是，外源性H2S能通過調控JAK/STAT通路對抗氧化應激引起的神經細胞損傷［11］。但是，H2S能否通過調控血管內皮細胞的JAK/STAT通路抑制高糖引起的損傷尚未見報道。

本文用人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)建立高糖損傷模型，重點研究外源性H2S對高糖激活HUVECs JAK/STAT通路的影響，觀察外源性H2S通過調控JAK/STAT通路保護HUVECs對抗高糖引起的多種損傷的效應，為進一步闡明外源性H2S對血管內皮細胞的保護作用機制提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

硫氫化鈉(NaHS)、DCFH-DA、羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自 Sigma-Aldrich; CCK-8試劑盒購自Dojindo;DMEM(低糖)培養基購自HyClone;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco;JAK2抗體、p-JAK2抗體和p-STAT3抗體購自CellSignaling Technology;STAT3 抗 體、cleaved caspase-3抗體和 GAPDH 抗體購自 Proteintech; HUVECs購自廣州吉妮歐公司。

2 方法

2.1 人臍靜脈內皮細胞的體外培養 細胞培養在含10%FBS的低糖DMEM培養基，同時加入100 U青霉素、100 mg鏈霉素，置于5%CO2、37℃的溫箱中培養。待細胞融合達80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，適度消化后加完全培養基終止胰蛋白酶的消化作用。用滅菌槍頭將瓶壁細胞吹落形成細胞懸液。1 200 r/min離心5 min，棄上清，按1∶3傳代。實驗前換用無血清的DMEM培養液培養12 h，然后進行分組實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為6組:正常對照(control) 組;高糖(high glucose，HG)損傷組:應用40 mmol/L葡萄糖處理 HUVECs 24 h;NaHS+HG組:400 μmol/L NaHS預處理HUVECs 30 min，撤去，用PBS 洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h;AG490 +HG組:20 μmol/L AG490(JAK/STAT通路抑制劑)作用于HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h;AG490組:20 μmol/L AG490作用于HUVECs 30 min，撤去，用PBS 洗2次，無血清培養基DMEM培養24 h;NaHS組: 400 μmol/L NaHS預處理HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，無血清培養基DMEM培養24 h。

2.3 CCK-8測定細胞存活率 根據CCK-8試劑盒說明書檢測 HUVECs活力。將HUVECs以每孔5 000細胞的密度接種于96孔板，當細胞生長80%時，給予上述不同處理。處理結束后，每孔加入無血清培養基稀釋的CCK-8工作液100 μL，37℃孵育2 h，使用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，波長設定為450 nm。按公式:細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，求出處理組細胞存活率，重復3次。

2.4 Western blot法檢測蛋白的表達 將HUVECs接種于60mm培養皿中，貼壁生長至80%時給予不同處理因素，棄培養液，用預冷的PBS洗2次，各皿加入80 μL裂解液后置4℃裂解30 min，12 000 r/ min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進行測定。總蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉90 min，分別加入I抗(p-JAK2和JAK2為1∶2 000，p-STAT3和STAT3為1∶5 000，cleaved caspase-3為1∶1 000)，4℃過夜，然后用 TBST洗10 min 3次，加入 II抗(1∶10 000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗10 min 3次。ECL發光液將PVDF膜顯色，凝膠成像系統掃描分析結果。

2.5 細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測 將HUVECs接種于24孔培養板中，當細胞生長貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養液，PBS沖洗3次，風干。將HUVECs與10 μmol/L DCFH-DA于37℃孵育30 min，棄去，再用PBS沖洗3次，風干。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，采用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均綠色熒光強度。

2.6 細胞線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential，MMP)的測定 將HUVECs接種于24孔培養板中，貼壁生長至大約80%時，給予各實驗組不同的處理因素，棄培養液，用PBS沖洗3次，風干。將HUVECs與10 μg/L Rh123于37℃避光孵育30 min，棄去，再用PBS沖洗3次，風干。在熒光顯微鏡下隨機地選取5個不重復區攝片，用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均熒光強度。

2.7 SOD活性的檢測 根據SOD檢測試劑盒說明書的操作步驟，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養液，用PBS沖洗，加入預冷的0.1 mol/L Tris/ HCl(pH 7.4)、0.5%Triton、5 mmol/L β-巰基乙醇以及0.1 g/L苯甲基氟磺酸裂解細胞，14 000×g離心5 min，取上清，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度，重復3次。

3 統計學處理

用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用SNK-q檢驗(實驗組組間比較)及Dunnett-t檢驗(實驗組與對照組比較)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑對抗高糖引起的細胞毒性

應用HG(40 mmol/L葡萄糖)處理HUVECs 24 h，可引起明顯的細胞毒性，使細胞存活率降低，與對照組相比，差異具有統計學顯著性(P＜0.01)。為了觀察JAK/STAT通路在HG降低細胞存活率的影響，我們觀察了不同濃度(5 μmol/L～80 μmol/L)JAK/ STAT通路抑制劑AG490對HG誘導的細胞毒性的作用，結果顯示:10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L濃度的AG490預處理HUVECs 30 min均能拮抗HG的細胞毒性，使細胞存活率上升(P＜0.05)。80 μmol/L AG490本身不引起細胞毒性。經統計學分析，濃度為20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L AG490等3組的抗細胞毒性作用無明顯的差異。根據此結果，后續實驗應用20 μmol/L的AG490為干預濃度。

此外，應用200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/ L和500 μmol/L濃度的NaHS分別預處理HUVECs 30 min，均可使細胞存活率上升。500 μmol/L NaHS本身不引起細胞毒性。這說明外源性H2S能對抗高糖誘導的細胞毒性。根據此實驗結果，后續實驗應用400 μmol/L NaHS為干預濃度，見圖1。

2 外源性H2S抑制高糖對人臍靜脈內皮細胞JAK/ STAT通路的激活

如圖2所示，應用HG處理HUVECs 9 h可明顯地激活JAK2，表現為p-JAK2的蛋白水平明顯升高，與對照組比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。但是，在HG處理HUVECs之前，應用400 μmol/L硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預處理30 min，可顯著抑制HG對p-JAK2的激活作用，使p-JAK2減少，與HG組相比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。另一方面，應用HG處理HUVECs 12 h可明顯地上調p-STAT3的蛋白水平(P＜0.05);然而，400 μmol/L NaHS預處理30 min能抑制HG對STAT3的激活作用，使p-STAT3的蛋白水平顯著降低，與HG組比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。

Figure 1.Inhibitor of JAK/STAT pathway and exogenous H2S protected HUVECs against HG-induced cytotoxicity.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖1 JAK/STAT通路抑制劑和外源性H2S保護HUVECs對抗高糖引起的細胞毒性

3 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑抑制高糖引起的人臍靜脈內皮細胞凋亡

應用HG分別處理HUVECs 3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能促進cleaved caspase-3的水平增加，其中處理12 h時，cleaved caspase-3的蛋白水平最高。與對照組分別比較均有統計學顯著性(P＜0.01)。因此，后續實驗以觀察HG處理HUVECs 12 h為觀察時點。

在HG處理HUVECs 12 h前應用400 μmol/L NaHS預處理 HUVECs 30 min能明顯抑制HG對cleaved caspase-3蛋白水平的上調作用，與HG組比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。

Figure 2.Exogenous H2S inhibited HG-induced activation of JAK/STAT pathway in HUVECs.Mean±SEM.n= 3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖2 外源性H2S抑制高糖對人臍靜脈內皮細胞JAK/ STAT通路的激活

另一方面，應用 20 μmol/L AG490預處理HUVECs 30 min能抑制HG對cleaved caspase-3蛋白水平的促進作用(P＜0.05)。400 μmol/L NaHS或20 μmol/L AG490本身對cleaved caspase-3的基礎水平無明顯影響，見圖3。

4 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑減輕高糖對人臍靜脈內皮細胞線粒體損傷

圖4顯示，應用HG處理HUVECs 24 h使細胞內反映MMP大小的Rh123平均熒光強度降低，兩組比較差異有統計學顯著性(P＜0.05)。但是，應用400 μmol/L NaHS預處理 HUVECs 30 min或 20 μmol/L AG490預處理HUVECs 30 min均能使MMP上升(P＜0.05)。400 μmol/L NaHS或20 μmol/L AG490本身不影響MMP的基礎水平。這說明外源性H2S能減輕HG對線粒體的損傷。

5 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑對抗高糖誘導的氧化應激

HG作用HUVECs 24 h可使胞內DCFH的MFI(為反映ROS水平的一個指標)顯著增強，與正常對照組相比，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。有意義的是，400 μmol/L NaHS預處理HUVECs 30 min或20 μmol/L AG490預處理HUVECs 30 min使MFI從(33.20±1.80)%降低至(23.86±1.90)%和(23.53 ±2.50)%。與HG組分別比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。說明外源性H2S能抑制HG引起的氧化應激，見圖5。

Figure 3.Exogenous H2S and the inhibitor of JAK/STAT pathway attenuated HG-induced apoptosis of HUVECs.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖3 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑抑制高糖引起的人臍靜脈內皮細胞凋亡

6 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑對抗高糖對SOD活性的抑制作用

HG作用HUVECs 24 h可使SOD的活性明顯降低，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。但是，400 μmol/L NaHS預處理HUVECs 30 min或20 μmol/L AG490預處理HUVECs 30 min均能減輕HG對SOD活性的抑制作用，與HG組分別比較，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。400 μmol/L NaHS 或20 μmol/L AG490本身對SOD的基礎活性無明顯影響，見圖6。

討論

Figure 4.Exogenous H2S and the inhibitor of JAK/STAT pathway attenuated HG-induced MMP loss in HUVECs.Mean±SEM.n= 5.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖4 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑減輕高糖對人臍靜脈內皮細胞線粒體損傷

Figure 5.Exogenous H2S and the inhibitor of the JAK/STAT pathway decreased ROS production in HG-induced HUVECs.Mean± SEM.n=5.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖5 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑保護人臍靜脈內皮細胞對抗高糖引起的ROS生成

高血糖是引起糖尿病血管病變(diabetic angiopathy)的重要病理生理機制之一。本文在人臍靜脈內皮細胞HUVECs模型再次證實，HG可激活HUVECs的JAK/STAT通路，表現為明顯地增加p-JAK2 和p-STAT3的水平;同時伴有多種損傷，包括降低細胞存活率，增加細胞凋亡(cleaved caspase-3增多)，促進氧化應激(胞內ROS生成增多和SOD活性降低)及線粒體損傷(MMP降低);應用JAK/STAT通路抑制劑AG490能阻斷HG引起的上述效應，提示JAK/STAT通路介導HG引起HUVECs的多種損傷，這與前文的報道［10］相一致。

Figure 6.Exogenous H2S and the inhibitor of JAK/STAT pathway blocked the inhibitory effect of HG on SOD activity in HUVECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs HG group.圖6 外源性H2S和JAK/STAT通路抑制劑阻斷高糖對HUVECs SOD活性的抑制作用

本文證實外源性H2S能明顯抑制HG對HUVECs的JAK/STAT通路的激活作用，使p-JAK2和p-STAT3的水平降低。H2S是一種新型的氣體信號分子，在血管中主要由胱硫醚γ-合成酶生成。越來越多的研究證實，H2S具有重要的心血管保護作用［1-6］。近年，H2S在糖尿病心血管并發癥中的作用受到高度重視。這主要是基于下述的研究成果:(1) 在2型糖尿病患者與糖尿病動物模型，血中H2S濃度較低［6，12］;(2)低濃度H2S與糖尿病血管炎癥有關［12］;(3)外源性H2S抑制HG引起的血管內皮細胞功能失調［6］;(4)外源性H2S能減輕糖尿病大鼠由于缺血/再灌注引起的心肌損傷［13］。近年來我們證實，外源性H2S可通過抑制絲裂原激活蛋白激酶［2］和NF-κB［3］等信號通路保護心肌對抗HG引起的損傷。本文發現，外源性H2S也能抑制HG對HUVECs JAK/STAT通路的激活。上述的研究提示，在糖尿病血管并發癥的病理生理機制中，內源性H2S對多種信號通路的調控作用減弱可能起著重要作用。

由于Suzuki等［6］報道H2S可通過保護線粒體功能對抗HG引起的血管內皮功能失調。因此，本研究進一步觀察了外源性H2S對HG損傷HUVECs作用的影響。研究結果表明，與JAK/STAT通路抑制劑AG490的結果類似，外源性H2S能明顯地保護HUVECs對抗HG引起的多種損傷，提示外源性H2S對抗HG誘導HUVECs多種損傷的作用機制之一可能與其抑制JAK/STAT通路有關。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Exogenous hydrogen sulfide attenuates high glucose-induced injury by inhibiting JAK/STAT pathway in human umbilical vein endothelial cells

LIN Jia-qiong1，2，CHEN Jing-fu3，LIAO Jing-qiu1，2，LIN Kai2，DENG Hai-ou2，WU Dong-bo4，WU Wen2

(1Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Endocrinology，East Ward，Guangdong Geriatric Institute，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China;3Departments of Cardiac Care Unit，Huangpu Division of The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China;4Department of Endocrinology，Affiliated Liuzhou Hospital of Southern Medical University，Liuzhou 545007，China.E-mail:wuwen1964@163.com)

AIM:To explore whether exogenous hydrogen sulfide(H2S)depresses high glucose(HG)-induced injury by modulating the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription(JAK/STAT)pathway in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).METHODS:The protein levels of JAK2，STAT3 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot.The cell viability was measured by CCK-8 assay.Mitochondrial membrane potential (MMP)was detected by rhodamine 123 staining followed by photofluorography.The intracellular level of reactive oxygen species(ROS)was analyzed by DCFH-DA staining followed by photofluorography.The activity of superoxide dismutase (SOD)was also measured.RESULTS:Pretreatment of the HUVECs with 400 μmol/L NaHS(a donor of H2S)for 30 min prior to exposure to 40 mmol/L glucose(HG)markedly attenuated HG-induced upregulation of the phosphorylation of JAK2 and STAT3.Pretreatment with 400 μmol/L NaHS for 30 min or with 20 μmol/L AG490(inhibitor of the JAK/STAT pathway)for 30 min attenuated the injury of HUVECs induced by HG，as indicated by the increases in cell viability and SOD activity，and decreases in the protein level of cleaved caspase-3，ROS generation and dissipation of MMP.CONCLUSION:Exogenous H2S protects HUVECs against HG-induced injury by inhibiting JAK/STAT pathway.

Hydrogen sulfide;JAK/STAT pathway;High glucose;Human umbilical vein endothelial cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.002

1000-4718(2016)07-1161-06

2016-02-17

2016-04-21

國家自然科學基金資助項目(No.81450062);廣東省自然科學基金資助項目(No.2015A030313872)

△Tel:020-83827812;E-mail:wuwen1964@163.com