溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的聯(lián)合效應(yīng)

趙素芬，胡飛，黃國輝，胡奕棟，陳嘉欣，何山，歐祥，孫會強（.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東　湛江　54088；.廣東海洋大學(xué)實驗教學(xué)部，廣東　湛江　54088）

溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的聯(lián)合效應(yīng)

趙素芬1，胡飛1，黃國輝1，胡奕棟1，陳嘉欣1，何山1，歐祥1，孫會強2
（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學(xué)實驗教學(xué)部，廣東湛江524088）

以全緣馬尾藻（Sargassum integerrimum）幼孢子體為對象，采用中心復(fù)合設(shè)計和響應(yīng)曲面法，研究了溫度（18～25℃）與鹽度（27～33）對其生長的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果表明，溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的影響具有明顯聯(lián)合效應(yīng)，溫度的影響大于鹽度。21.5℃、鹽度30條件下，幼孢子體的體長增長率和體寬增長率均達到最大值，但易滋生雜藻；在光照強度5 000 lx、溫度16.5～26.5℃和鹽度25.8～34.2時，溫度與鹽度的一次、二次效應(yīng)以及二者間的聯(lián)合效應(yīng)對全緣馬尾藻幼孢子體生長的影響無統(tǒng)計學(xué)意義差異（P＞0.05），表明此范圍為全緣馬尾藻幼孢子體生長的適宜溫度與鹽度范圍。全緣馬尾藻幼孢子體長度的平均增長率與溫度、鹽度的二次回歸方程模型擬合效果較好。

全緣馬尾藻；幼孢子體；生長；溫度；鹽度；聯(lián)合效應(yīng)

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.04.007

全緣馬尾藻（Sargassum Integerrimum）是我國特有的馬尾藻屬（Sargassum）海藻品種，生長在低潮帶石沼中，集中分布在廣東省湛江市的硇洲島海域［1］。全緣馬尾藻的脂肪含量低，不溶性膳食纖維和不飽和脂肪酸含量豐富，藻體中Ca、Fe、Mn等礦質(zhì)元素含量較高；藻體中含有的褐藻多酚具有抗氧化和抗腫瘤細胞增值的作用［2-3］，是一種理想的天然保健原料。近年來，隨著海洋的污染和海洋資源的過度捕撈，全緣馬尾藻資源數(shù)量在逐年減少，有必要開展該品種的人工栽培技術(shù)研究。目前有關(guān)馬尾藻生態(tài)學(xué)的研究成果較多，但大多只涉及單一因素的作用，生態(tài)因子間的聯(lián)合效應(yīng)研究比較少［4-6］。孫宗紅等［7］研究了溫度對全緣馬尾藻幼孢子體生長和生理組分的影響，而有關(guān)多因子與全緣馬尾藻生長的聯(lián)合效應(yīng)研究未見報道。本文采用中心復(fù)合設(shè)計和響應(yīng)曲面方法，研究了溫度與鹽度的聯(lián)合效應(yīng)對全緣馬尾藻幼孢子體生長的影響，目的在于確定全緣馬尾藻幼孢子體的最佳培養(yǎng)溫度、鹽度條件，建立溫度、鹽度與全緣馬尾藻幼孢子體生長的連續(xù)變量曲面模型，模型擬合程度好，可對生長率進行較好的分析與預(yù)測，這對指導(dǎo)全緣馬尾藻的生產(chǎn)實踐有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

全緣馬尾藻種藻采自廣東徐聞（N 20°13.855'，E 110°6.725'）海域，將雌、雄藻體分別裝箱，用濕運法運至廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)樓的海藻實驗室。用經(jīng)雙層300目篩絹過濾的海水清洗藻體表面的附著物，將成熟度好的雌、雄藻體一起放入裝滿過濾海水的白色塑料桶中，使其分別放散卵與精子，并自由完成受精過程，生長成幼孢子體。幼孢子體培養(yǎng)條件：海水溫度18～22℃，自然光照，光照強度介于0～10 000 lx，充氣使水呈沸騰狀，每3 d更換一次培養(yǎng)用水。實驗幼孢子體長度2～5 mm，寬度0.3～0.5 mm。

1.2實驗設(shè)計

采用Design-Expert響應(yīng)面分析中的中心復(fù)合設(shè)計法（Central Composite design，CCD），以溫度（T，18～25℃）和鹽度（S，27～33）兩個因素為自變量，平均增長率為響應(yīng)值，采用2因素5水平，因子點數(shù)4，軸點數(shù)4，中心點數(shù)5，共13組進行實驗（表1）。光照強度5 000 lx，光周期12L：12D，每個實驗組設(shè)3個平行。溫度由微電腦培養(yǎng)箱（型號SPX-250BG，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）控制，鹽度由純凈水與海水晶調(diào)配而成。

1.3方法

用Ф6 cm培養(yǎng)皿作培養(yǎng)容器，用前經(jīng)清洗、消毒處理，海水經(jīng)雙層300目篩絹過濾、消毒并冷卻后備用。每個培養(yǎng)皿添加15 mL PES培養(yǎng)液［8］，投放5棵大小較一致、健壯的全緣馬尾藻幼孢子體。投放前將幼孢子體用軟毛筆輕輕洗刷干凈，去除雜藻與其他附著物，并測定各苗的大小（長度、寬度），記錄其分枝數(shù)量。每天定時搖動培養(yǎng)皿4次，觀察并記錄幼孢子體的死亡數(shù)，每3 d換皿、換水1次，并測定幼孢子體的長度與寬度，記錄其分枝數(shù)，計算全緣馬尾藻幼孢子體的體長平均增長率LGR%＝100× （lnLt-lnL0）/t及體寬平均增長率WGR%＝100× （lnWt-lnW0）/t，其中L0、W0分別代表實驗開始時全緣馬尾藻幼孢子體的長度與寬度，Lt與Wt分別代表培養(yǎng)t時間后全緣馬尾藻幼孢子體的長度與寬度［9］。實驗周期15 d。

1.4數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Design-Expert（8.0.6）軟件處理數(shù)據(jù)，建立全緣馬尾藻平均增長率與溫度（T）和鹽度（S）之間的回歸方程模型，并繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線圖，求得最佳的實驗組合。有統(tǒng)計學(xué)意義水平為P＜0.05，極有統(tǒng)計學(xué)意義水平為P＜0.01。

2　結(jié)果

2.1溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的影響

表1　培養(yǎng)15 d，不同溫度、鹽度組全緣馬尾藻幼孢子體的生長

2.1.1對體長生長的影響全緣馬尾藻幼孢子體培養(yǎng)15 d，長度的平均增長率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)第6天平均增長率達到最高值，其中在21.5℃、30條件下，最高達6.23%，第15天下降為最高3.91%（表1）。分別用培養(yǎng)第6天和第15天全緣馬尾藻的體長平均增長速率，制作溫度、鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體體長生長的等高線圖及響應(yīng)曲面圖（圖1-2）。從圖1、圖2可見，溫度、鹽度的響應(yīng)曲面并不陡峭，說明溫度、鹽度對全緣馬尾藻平均增長率的影響不顯著。

圖1　溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體體長生長（A：培養(yǎng)6d后；B：培養(yǎng)15d后）影響的等高線

圖2　溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體體長生長（A：培養(yǎng)6d后；B：培養(yǎng)15d后）影響的響應(yīng)面

對培養(yǎng)6 d及15 d全緣馬尾藻幼孢子體長度的平均增長率進行方差分析，結(jié)果表明，模型、溫度和鹽度的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)以及它們之間的聯(lián)合效應(yīng)P值均遠遠大于0.05，說明建立的二次回歸模型并無統(tǒng)計學(xué)意義；R2值分別為0.066和0.12小于0.5，說明溫度、鹽度與平均增長率之間的非線性關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項的P值分別為0.51和0.24，大于0.05，表明擬合的模型是有效的。溫度對幼孢子長度生長的影響效應(yīng)要比鹽度以及二者的聯(lián)合效應(yīng)大。

對實驗數(shù)據(jù)進行二元二次回歸方程擬合，全緣馬尾藻幼孢子體長度的平均增長率（LGR）與溫度（T）、鹽度（S）之間的回歸方程為：

2.1.2對體寬生長的影響培養(yǎng)15 d，全緣馬尾藻幼孢子體寬度的平均增長率總體呈現(xiàn)下降的趨勢。培養(yǎng)3 d，21.5℃、30條件下生長率達到最大，為17.44%，15 d后的生長率最高為7.24%。對培養(yǎng)3 d 和15 d的全緣馬尾藻幼孢子體寬度平均生長率進行方差分析，結(jié)果表明，模型、溫度與鹽度的一次、二次效應(yīng)以及溫度、鹽度之間聯(lián)合效應(yīng)的P值均大于0.05，說明溫度、鹽度以及二者的聯(lián)合效應(yīng)對幼孢子體寬度的生長影響無統(tǒng)計學(xué)意義；溫度生長效應(yīng)比鹽度以及二者的聯(lián)合效應(yīng)大。R2值分別為0.45 和0.35均小于0.5，說明溫度、鹽度與平均增長率之間的非線性關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項為0.0501和0.005，較小，表明建立的二元二次回歸方程模型擬合效果和預(yù)測能力較差。

對實驗數(shù)據(jù)進行二元二次回歸方程擬合，全緣馬尾藻幼孢子體寬度的平均增長率（WGR）與溫度（T）、鹽度（S）之間的回歸方程為：

分別用培養(yǎng)3 d和15 d全緣馬尾藻的體寬平均增長速率，制作溫度、鹽度及二者的聯(lián)合效應(yīng)與全緣馬尾藻幼孢子體寬度生長的等高線圖及響應(yīng)曲面圖（圖3—4）。響應(yīng)曲面并不陡峭，等高線較圓，說明溫度與鹽度對全緣馬尾藻體寬平均增長率的聯(lián)合效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3　溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體體寬生長（A：培養(yǎng)3d后；B：培養(yǎng)15d后）影響的等高線

圖4　溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體體寬生長（A：培養(yǎng)3d后；B：培養(yǎng)15d后）影響的響應(yīng)面

2.2對幼孢子體成活率和分枝生長的影響

2.2.1對幼孢子體成活率的影響培養(yǎng)15 d，全緣馬尾藻幼孢子體在各條件下的成活率見圖5。21.5℃、30組在培養(yǎng)第3天出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，培養(yǎng)15 d后病死率為8%，18℃、33組與16.55℃、30組分別于培養(yǎng)第6天和第12天出現(xiàn)死亡，病死率均保持為6.7%。在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)溫度＜21.5℃時，同樣溫度下，鹽度偏高全緣馬尾藻幼孢子體的病死率偏高，而當(dāng)溫度≥25℃時，全緣馬尾藻幼孢子體無死亡現(xiàn)象。

2.2.2對幼孢子體分枝數(shù)的影響方差分析顯示，在不同溫度、鹽度組合條件下全緣馬尾藻幼孢子體分枝數(shù)量變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)溫度＜25℃時，同樣溫度下，鹽度升高全緣馬尾藻幼孢子體的分枝數(shù)明顯增多，而當(dāng)溫度≥25℃時，同樣溫度下，鹽度升高全緣馬尾藻幼孢子體的分枝數(shù)明顯減少。15 d后以21.5℃、34.24組的分枝數(shù)增長率最高，達32.59%，與其他組差異有意義，而25℃、33組的分枝數(shù)增長率最低，僅4.44%（圖6）。

圖5　不同溫度、鹽度下全緣馬尾藻幼孢子體的成活率

圖6　不同溫度、鹽度下全緣馬尾藻幼孢子體的分枝生長

3　討論

3.1溫度、鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的影響

海水溫度間接影響海藻的光合作用與呼吸作用強度，影響海藻的生長發(fā)育［1］，主要與幼孢子體體細胞內(nèi)參與各種新陳代謝的酶活性有關(guān)［10-11］。鹽度主要通過調(diào)節(jié)藻體細胞內(nèi)外的滲透壓來影響海藻的呼吸作用、光合速率、葉綠素含量等，影響其生長。該研究結(jié)果表明，溫度、鹽度的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)對幼孢子體的生長影響無統(tǒng)計學(xué)意義，即表明光照強度5 000 lx，16.5～26.5℃、25.8～34.2均適宜全緣馬尾藻幼孢子體生長，為其生長的適宜或最適溫度、鹽度范圍，其成活率達92%以上。溫度21.5℃、鹽度30時，幼孢子體的平均生長率達最高值，與孫宗紅等［7］研究的溫度結(jié)果相似。與Clinton J D等［12］認為馬尾藻（S.filipendula）的適宜鹽度為15～35相符，也與張建偉等［5］認為瓦氏馬尾藻在鹽度20～40范圍內(nèi)生長率差異無統(tǒng)計學(xué)意義上的相似。

3.2溫度與鹽度對全緣馬尾藻幼孢子體生長的聯(lián)合效應(yīng)

海藻生活的海洋環(huán)境中，海水溫度、鹽度以及光照強度等生態(tài)因素時刻在變化，對生態(tài)因素間聯(lián)合作用的分析比單獨分析因素的主效應(yīng)重要得多［13］。該研究發(fā)現(xiàn)溫度與鹽度的聯(lián)合效應(yīng)對全緣馬尾藻幼孢子體體長、體寬平均增長速率影響均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。可能由于溫度、鹽度的范圍設(shè)置過小，或者在光照強度5 000 lx時，溫度與鹽度的聯(lián)合效應(yīng)未能發(fā)揮作用，此時光照為關(guān)鍵限制因素。有關(guān)這些生態(tài)因子對全緣馬尾藻幼孢子體生長的聯(lián)合效應(yīng)，有待進一步深入研究。

溫度21.5℃，鹽度30時，與其他組相比，雜藻數(shù)量多，雜藻附著在幼孢子體上，影響幼孢子體的光合作用與呼吸代謝，并與幼孢子體競爭營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致了弱小幼孢子體生長受阻并死亡。培養(yǎng)后期，隨著幼孢子體的生長，雜藻的影響減弱，幼孢子體的成活率穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的上升，雜藻生長受到抑制，幼孢子體無死亡，故在適宜溫度范圍內(nèi)，提高溫度有利于幼孢子體的生長。

全緣馬尾藻屬于頂端生長類型［1］，對于固著生長的藻體，分枝數(shù)量增多，會影響藻體的向上直立生長，而該研究藻體漂浮在培養(yǎng)液中自由生長，并且為早期幼孢子體，分枝數(shù)增長率最高的21.5℃、34.24組，其藻體的體長及體寬生長率均僅次于最高組。分枝數(shù)增長率最低的25℃、33組，培養(yǎng)15 d后，其藻體的體長增長率僅次于最低組，體寬生長率為最低組。因此，懸浮培養(yǎng)的全緣馬尾藻幼孢子體，分枝數(shù)量的生長一定程度上反映了藻體的生長情況。

［1］趙素芬.海藻與海藻栽培學(xué) ［M］.北京:國防工業(yè)出版社，2012:178-241.

［2］盧虹玉，楊小青，謝恩義.全緣馬尾藻的主要營養(yǎng)成分分析與評價［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（7）:120-122.

［3］盧虹玉，劉義，吉宏武，等.全緣馬尾藻褐藻多酚的抗氧化和抗腫瘤細胞增殖作用研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29 （4）:702-705.

［4］張建偉，劉媛媛，吳海龍，等.環(huán)境因子對瓦氏馬尾藻生長及光合作用的影響 ［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2014，21（6）: 1227-1235.

［5］孫圓圓，孫慶海，孫建璋.溫度對羊棲菜生長的影響［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，28（3）:342-347.

［6］楊彬，謝恩義，曲元凱.不同環(huán)境因子對莫氏馬尾藻幼苗生長和光合色素的影響［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2013，9（4）:39-44.

［7］孫宗紅，麥惠欣，劉志剛，等.溫度對全緣馬尾藻幼孢子體生長和生理組分的影響［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2015，35 （1）:51-56.

［8］王素娟，何培民，嚴(yán)興洪，等.海藻生物技術(shù)［M］.上海:上海科技出版社，1994:17-l8.

［9］Chu S H，Zhang Q S，Tang Y Z，et al.High tolerance to fluctuating salinity allows Sargassum thunbergii germlings to survive and grow in artificial habitat of full immersion in intertidal zone［J］.Journal of Experimental Marine Biology and E-cology，2012，412（31）:66-71.

［10］潘瑞熾，董愚得.植物生理學(xué) ［M］.北京:高等教育出版社，1995:74-77.

［11］蔡西栗.龍須菜對溫度和鹽度逆境脅迫的生理響應(yīng)［D］.寧波:寧波大學(xué)，2012:15-28.

［12］Clinton J D，David A T.Physiological responses of perennial bases of Sargassum filipendula from three sites on the west coast of Florida［J］.Bulletin of Marine Science，1988，42（2）: 166-173.

［13］Montgomery，D C.Design and analysis of experiments ［M］.New York:Wiley，1984:384-418.

The joint effects of temperature and salinity on the growth of Sargassum integerrimum germlings

Zhao Sufen1，Hu Fei1，Huang Guohui1，Hu Yidong1，Chen Jiaxin1，He Shan1，Ou Xiang1，Sun Huiqiang2
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；2.Education Example Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Using center composite design and response surface method，the combined effects of temperature and salinity on the growth rate（GR）of Sargassum integerrimum germlings were studied.The results showed that temperature and salinity affected the GR of S.intrgerrimum seedlings distinctly，and the effect of temperature was greater than that of salinity.The maximum body length growth rate（LGR）and maximum body width growth rate（WGR）were reached when the 2-factor combination was 21.5℃/30，however，attached seaweeds were also easy to grow.Under the light intensity 5 000 lx，temperature 16.5-26.5℃ and salinity 25.8-34.2，the linear and quadratic effects of temperature，salinity and their joint effect are not statistically significant（P＞0.05）.It is indicated that the temperature and salinity range are suitable for germlings to grow.The quadratic regression equation model of average length growth rate，temperature and salinity performs better.

Sargassum integerrimum；growth；temperature；salinity；joint effect

Q175

A

1004-2091（2016）04-0032-07

廣東省科技計劃項目（2009B080701048）；廣東海洋大學(xué)引進人才科研啟動費項目（1112386）；廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（CXXL2015044）

趙素芬（1970-），女，副教授，主要從事海藻生物學(xué)及海藻健康栽培理論與技術(shù)的研究.E-mail：sufzhao@126. com

（2015-07-21）