松潘烏頭總堿半數致死量的實驗研究*

張　政，鄧月婷，王小芳，任　遠，張喜民△甘肅隴神戎發藥業股份有限公司，甘肅蘭州7300；甘肅中醫藥大學

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松潘烏頭總堿半數致死量的實驗研究*

張政1，鄧月婷1，王小芳1，任遠2，張喜民1△
1甘肅隴神戎發藥業股份有限公司，甘肅蘭州730101；2甘肅中醫藥大學

目的:研究松潘烏頭總堿對小鼠的半數致死量（LD50），為藥理實驗和臨床安全合理用藥提供依據。方法:將松潘烏頭粉碎后，用碳酸鈉溶液浸潤，經乙醇超聲提取，硫酸溶解，氨水調pH，用乙醚：氯仿（3：1）混合溶液萃取，得松潘烏頭總堿。根據預實驗結果將60只小鼠分為6組，按照200、160、128、102.4、81.9、65.5mg/kg的劑量一次性灌服小鼠后觀察24小時內情況。記錄小鼠中毒癥狀及死亡情況，觀察松潘烏頭總堿的急性毒性。結果:松潘烏頭總堿經口服給藥小鼠的LD50為119.78mg/kg，其95%可信區間為103.86～139.28 mg/kg。結論:松潘烏頭總堿有中等毒性，其半數致死量為119.78mg/kg。

松潘烏頭總堿；小鼠；半數致死量

松潘烏頭（Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.）為毛茛科烏頭屬植物，以根入藥，主要產于甘肅、陜西、寧夏、山西、青海、四川。本品味辛、苦，性溫，有大毒，具有祛風止痛、散瘀消腫之功效。民間用于跌打損傷、風濕性和類風濕性關節炎等疾病。研究發現松潘烏頭中主要化學成分為生物堿，其中二萜類生物堿是其主要有效成分，也是其有毒成分［1-2］。目前，松潘烏頭研究主要集中在化學成分、藥理等作用方面。但其口服給藥的安全性文獻報道極少，現就松潘烏頭總堿的急性毒性進行研究，以期為新藥研發與臨床安全、合理用藥等提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體質量18～22g，實驗動物質量合格證號SCXK（甘）2011-0001，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供。溫度20～24℃，濕度40%～50%。小鼠每籠10只，雌雄分籠飼養，自由飲水，食固體飼料為SPF級，購自北京科奧協力飼料有限公司。

1.2藥物與試劑松潘烏頭采自甘肅天水，由甘肅林業職業技術學院任繼文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物；氯仿、乙醚、乙醇、吐溫-80均為分析純。

1.3儀器KH-500D E型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；RE-2000型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；JA2603B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）。

1.4實驗方法

1.4.1松潘烏頭總堿的制備取松潘烏頭藥材，粉碎后過60目篩，用10%碳酸鈉溶液浸潤，加入5倍量75%乙醇于超聲中提取30分鐘，重復提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入10倍量2%硫酸溶液溶解并過濾，過濾后濾液中加入氨水調pH至9～10，用乙醚∶氯仿（3∶1）混合溶液按1∶1萃取3次，合并萃取液，減壓回收至少量，轉移至蒸發皿中蒸干，刮取浸膏至稱量瓶中，放置于硅膠真空干燥器中至恒重，備用。用酸性染料比色法測定其生物堿含量為74.35%。

1.4.2松潘烏頭總堿急性毒性實驗研究

1.4.2.1松潘烏頭總堿的配制精密稱取1.000g松潘烏頭總堿干燥品，加入新制的5%吐溫-80 50mL。超聲至完全溶解，放冷稱重，補足重量，用封口膜密封，于4℃冰箱保存，為20mg/mL母液。實驗時采用“低比稀釋法”配藥，用5%吐溫-80配制系列濃度藥液。

1.4.2.2急性毒性預實驗目的在于先確定引起0%（Dn）和100%（Dm）死亡率劑量的所在范圍。取小鼠20只，分為5組，每組4只，禁食12小時，自由飲水。按400、283、200、141、100mg/kg的給藥劑量1次灌胃給藥，記錄和觀察給藥后24小時內的死亡情況和中毒反應，結果發現200mg/kg時小鼠全部死亡。第2次預實驗，取小鼠20只，分為5組，每組4只，按200、140、98、68.6、48mg/kg的給藥劑量一次灌胃給藥，觀察并記錄給藥后24小時內的死亡情況和中毒反應，結果劑量為68.6mg/kg時，4只小鼠全部存活，確定了Dn為68.6mg/kg，Dm為200mg/kg。

1.4.2.3急性毒性實驗預實驗測得Dn為68.6mg/kg，Dm為200mg/kg，二者相差倍數為3，按表1選擇分組及劑量比值，查表以K=0.8，N=6為宜。因此6個劑量組的劑量分別為200、160、128、102.4、81.9、65.5mg/kg。將60只小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，用苦味酸標記。實驗前禁食不禁水12小時，一次性灌胃給藥，給藥容積為0.03m L/g，給藥后7天內密切觀察各組動物反應，見表1。

表1　選擇分組及劑量比值

2　結果

2.1小鼠灌胃后一般活動情況及死亡情況小鼠中毒癥狀首先是自發活動減少，接著出現腹式呼吸、呼吸急促、運動失調等，部分小鼠全身被毛濕潤，最終出現抽搐、角弓反張后死亡。中毒癥狀出現的時間集中在給藥后15分鐘內，死亡時間集中在給藥后4小時內。觀察過程中發現癥狀較輕的小鼠會在出現毒性癥狀后逐漸恢復。死后立即解剖，肉眼可見小鼠胃充盈，腸管脹氣，余未見異常。不同劑量的松潘烏頭總堿致死小鼠數量統計，見表2。

表2　各組小鼠死亡情況

2.2半數致死量按B l iss法統計各組死亡鼠數和死亡率，結果用S P SS軟件計算［3］松潘烏頭總生物堿的L D50為119.78 mg/kg，95%可信區間為103.86～139.28mg/kg。

3　討論

松潘烏頭在中醫古籍中已有記載，《神農本草經》曰：“主中風，惡風，洗洗出汗，除寒濕痹，咳逆上氣，破積聚寒熱”；《藥類法象》曰：“治風痹血痹，半身不遂，行經藥也。”現代藥理證明，松潘烏頭總堿有鎮痛、解熱、抗炎作用［4］，其鎮痛作用持續時間長且無耐受性和身體依賴性［5］。因其毒性，松潘烏頭的應用受到了限制，但其顯著的療效又吸引著藥學工作者的關注，因此為進一步開發利用，有必要對其有效成分進行分析并提取純化，達到降低毒性，提高療效的目的。相關研究對其半數致死量進行分析［3］，小鼠口服LD50為（8.66±0.58）mg/kg（P=0.95），為劇毒物，起藥效作用的劑量為0.5～3.0mg/kg，該文獻中采用的松潘烏頭總堿（含量1.14%）用藥安全性較低，不利于進一步開發。本研究對松潘烏頭進行提取純化，得生物堿含量為74.35%的松潘烏頭總堿，通過實驗測得松潘烏頭總堿對小鼠的LD50為119.78 mg/kg，按急性毒性分級標準分為中等毒性。同期進行的熱板實驗與醋酸扭體實驗結果表明給藥劑量為LD50的1/40，即3mg/kg時能顯著提高小鼠痛閾、抑制小鼠扭體反應，12mg/kg時鎮痛作用與嗎啡相當，該工藝制備的松潘烏頭總堿安全窗大，為該藥物制劑的后續開發及應用提供了安全保證。

［1］李洪剛，李廣義.松潘烏頭二萜生物堿的研究［J］.藥學學報，1988，23（6）:460-461.

［2］王銳，倪京滿，胡兆勇，等.松潘烏頭中的二萜生物堿研究［J］.蘭州醫學院學報，1991，17（4）:201-204.

［3］周一平.用SPSS軟件計算新藥的LD50［J］.藥學進展，2003， 27（5）:314-316.

［4］楊軍英，黨月蘭.松潘烏頭總堿的抗炎解熱作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2003，8（4）：441-443.

［5］黨月蘭，胡兆勇，吳福祥.松潘烏頭總堿的鎮痛作用和身體依賴性的實驗研究［J］.中國藥物依賴性通報，2005，2（4）: 242-246.

Experim entalStudy on LethalMedian Doseof TotalA lkaloidsof SongPan WuTou

ZHANG Zheng1，DENG Yueting1，WANG Xiaofang1，REN Yuan2，ZHANG Ximin1△
1 Gansu Longshen Rongfa Pharmaceutical Company，Ltd.，Lanzhou 730101，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide the reference for pharmacological experiment and rationalmedication in clinic by study lethalmedian dose of total alkaloids of SongPan WuTou（Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.）. Methods:Total alkaloids of SongPan WuTou were obtained by smashing SongPan WuTou，soaking it in sodium carbonate solution，processing by ethanol ultrasonic extraction，dissolving in sulphuric acid，adjusting the pH of the solution，extracting by themixture of aether and chloroform.According to the results of prelim inary experiment，sixtym icewere random ized into six groups，the conditionsw ithin 24 hourswere observed after themice received gavage of total alkaloids of SongPan WuTou according to the doses:200，160，128，102.4，81.9 and 65.5mg/kg. Poisoning symptomsand the death of them icewere recorded to observe acute toxicity of total alkaloids of SongPan WuTou.Results:LD50of totalalkaloidsof SongPan WuTou w as119.78mg/kg，its95%credibility intervalsw ere from 103.86to139.28mg/kg.Conclusion:Totalalkaloidsof SongPanWuTou showmoderatetoxicity，anditsLD50is119.78mg/kg.

totalalkaloidsof SongPan WuTou；mice；lethalmedian dose

R285.5

A

1004-6852（2016）03-0019-03

2014-12-28

蘭州市科技局項目蘭州市2011年創新人才團隊培育計劃（編號2011-1-140）。

張政（1985—），女，碩士學位，工程師。研究方向：新藥研究與開發。

△張喜民（1956—），男，正高級工程師。研究方向：新藥研究與開發。