免疫調節劑CH2b對葡萄糖-6-磷酸異構酶混合肽段誘導的類風濕性關節炎小鼠的影響①

劉嘉琳　張雪嬌　楊　飛　婁永富　孟　明　陳冬志②

(河北大學基礎醫學院，保定071000)

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·基礎免疫學·

免疫調節劑CH2b對葡萄糖-6-磷酸異構酶混合肽段誘導的類風濕性關節炎小鼠的影響①

劉嘉琳張雪嬌楊飛婁永富③孟明③陳冬志②③

(河北大學基礎醫學院，保定071000)

①本文為國家自然科學基金(NSFC)(81373197)、河北省自然科學基金(H2014201133，H2015201131)、河北大學醫學學科建設基金(2014A1001，2014A1002)和國家級大學生創新項目基金(201510075030)。

②河北大學醫學部，保定071000。

目的：探究前期合成的含噻唑烷-4-酮的免疫調節劑CH2b對葡萄糖-6-磷酸異構酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段誘導的類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)小鼠發病的影響。方法：hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段與完全弗氏佐劑充分乳化后，于DBA/1小鼠尾根部多點皮下注射，并用百日咳毒素加強免疫。然后分別用α-半乳糖神經酰胺(α-GalCer)和CH2b對模型小鼠進行干預，監測各組小鼠體重變化和足踝關節腫脹變化情況，關節組織蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色法觀察炎細胞浸潤情況，流式細胞技術(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測全血中iNKT細胞頻率變化，微量樣本多指標流式蛋白定量技術(Cytometric bead array，CBA)檢測血清中細胞因子TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ水平。結果：與GPI混合肽段誘導的模型組相比，α-GalCer和免疫調節劑CH2b均可顯著改善模型小鼠的體重增長緩慢、關節腫脹情況(P<0.05)；炎性細胞浸潤減少；且二者均可以顯著提高RA小鼠體內iNKT細胞的頻率，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；α-GalCer、CH2b組可以降低模型小鼠炎癥高峰期TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，兩組結果差異無統計學意義(P>0.05)。 結論：免疫調節劑CH2b通過激活iNKT細胞影響炎性細胞因子的分泌，緩解GPI混合肽段誘導的關節炎。

免疫調節劑CH2b；α-GalCer；葡萄糖-6-磷酸異構酶；iNKT細胞

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因復雜的慢性自身免疫性疾病，可累及全身關節和多臟器，其發病基礎是免疫失衡和過度炎癥反應。iNKT(invariant nature killer T,iNKT)細胞是近年發現的一群特殊細胞群，兼具NK細胞功能和T細胞特點，在腫瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病中發揮強大作用[1,2]。一方面，直接發揮殺傷作用于靶器官，另一方面，通過分泌細胞因子和趨化因子[3]，發揮致炎或抑炎雙向功能，糾正免疫平衡，維持免疫耐受，發揮免疫調節，是鏈接固有免疫和適應性免疫的橋梁，被譽為免疫系統的“瑞士軍刀”[4]。已有研究表明，RA患者體內存在iNKT細胞頻率、功能的缺陷，治療后可隨病情的緩解而恢復[5]，且iNKT細胞頻率變化與患者體內IFN-γ/IL-4比值呈負相關[6]。本課題組前期設計合成的類核苷衍生物含噻唑烷-4-酮的免疫調節劑CHs在體外實驗中能顯著促進iNKT細胞增殖和殺靶活性[7,8]，降低IFNγ/IL-4 比值，并可以激活轉錄因子GATA-3 使iNKT分化傾向Th2優勢[6]。

葡萄糖-6-磷酸異構酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)是廣泛應用于臨床RA診斷及判斷活動性的一個常用檢測指標，抗原rhGPI誘導的關節炎在CD4+T細胞的依賴性和抗TNF-α、IL-6反應性方面更加接近RA患者特點，是一種新型的關節炎模型[9]。Lisa[10]認為GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性片段，誘導DBA/1小鼠發生關節炎，但單肽段的效果不如整個GPI蛋白。我們前期預實驗發現混合肽段誘導效果強于單一肽段，且相比整個蛋白更加經濟、易得。Horikosh[9]應用iNKT細胞經典激活劑α-半乳糖神經酰胺(α-GalCer)干預GPI誘導的關節炎小鼠，小鼠癥狀得到緩解。本實驗旨在研究免疫調節劑CH2b對葡萄糖-6-磷酸異構酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段誘導的RA小鼠的體內作用效果，以α-Galcer為陽性對照，通過觀察其對模型小鼠體重、關節腫脹程度、足踝關節組織病理、外周血iNKT細胞頻率、血清細胞因子的影響，為后續RA靶向治療提供新的科學依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1動物DBA/1小鼠60只，雄性，8周，體重(20±1)g，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.1.2試劑與儀器化合物CH2b由本課題組前期合成；多肽片段hGPI325-339(IWYINCFGCETHA ML)、hGPI469-483(EGNRPTNSIVFTKLT)由北京賽百盛基因技術有限公司合成(1407182)；百日咳毒素(P7208)和完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant，CFA，F5881)為美國Sigma公司產品；α-Galcer為ENZO Life Sciences公司產品；FITC標記的CD4抗體(553046)、微量樣本多指標流式蛋白定量技術(CBA)Th1/Th2/Th17細胞因子檢測試劑盒(560485)、紅細胞裂解液(555899)為美國BD公司產品；PE標記的T-selected-CD1d Tetramer日本MBL公司產品；BSA為Mp biomedicals New Zealand(MP Biomedicals)公司產品；PBS 為Solarbio公司產品；熒光倒置顯微鏡為 TH4-200，日本Olympus 公司產品；流式細胞儀Calibur、Accuri C6為BD 公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組DBA/1小鼠，隨機取出15只作為健康對照組；45只小鼠進行混合肽段人工造模：每75 μl預冷三蒸水中溶解50 μg hGPI325-339和hGPI469-483多肽片段，所得溶液與CFA等體積充分乳化為乳化劑，于小鼠尾根部150 μl/只皮下注射，0 h、48 h腹腔注射200 ng/只百日咳毒素。然后將45只小鼠隨機分為3組，一組不做任何處理，為模型組；一組造模當日應用α-GalCer(2 μg/只)尾根注射，為α-GalCer組；剩下一組用CH2b(2 μg/只)連續腹腔注射7 d，為CH2b組。

1.2.2小鼠一般狀況評估造模后監測小鼠體重動態變化，每4 d稱量小鼠體重；每天觀察小鼠足踝紅腫程度，對小鼠關節紅腫程度量化，進行系統評分，其標準為：1分表示足趾有輕度紅腫；2分表示明顯可見的足背、足掌紅腫；3分表示足踝出現紅腫，依此評估每只小鼠關節情況。

1.2.3小鼠關節組織HE染色造模后第8天、第14天、第37天小鼠眼球取血，備用。斷頸椎處死置于75%乙醇中，剪下鼠爪后置于10%福爾馬林溶液中固定。然后進行脫水、透明、石蠟包埋切片(5 μm)，二甲苯(Ⅰ 、Ⅱ)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗。然后蘇木素染色15 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，自來水返藍15 min，水洗，1%乙醇伊紅染色3 min。脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

1.2.4小鼠iNKT細胞頻率檢測預先處理CD1d四聚體：0.5%Tween-20和0.9%NaCl將1 mg/ml的α-GalCer稀釋至200 μg/ml，每100 μl CD1d Tetramer中加入5 μl稀釋后的α-GalCer，室溫孵育12 h，置4℃備用。將各期小鼠所得全血120 μl/只于流式管中，用BSA阻斷非特異性染色，FITC標記的Anti-CD4、PE標記的負載α-GalCer的CD1d四聚體各2 μl，避光孵育20 min。然后加紅細胞裂解液1 ml，避光孵育8 min，澄清透亮后離心1 000 r/min，5 min，棄上清，PBS洗滌2次，重懸后加PBS 500 μl，流式細胞儀Calibur上機檢測，FlowJo軟件(Tree Star公司)數據分析。

1.2.5CBA檢測細胞因子收集各期小鼠血清，應用CBA 細胞因子試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平。嚴格按照說明書進行操作：制備標準品，混合捕獲微球，每實驗管中加入捕獲微球50 μl，每標準品管中加入梯度稀釋好的標準品50 μl，每樣本管中加入樣本50 μl，然后所有管均加入 PE檢測試劑50 μl，避光孵育2 h(室溫)，每管加入洗液1 ml，1 500 r/min，離心5 min，棄上清后，各加洗液300 μl，重懸，流式細胞儀Accuri C6上機檢測，用FCAP軟件(BD公司)進行數據分析。

2　結果

2.1CH2b對RA模型小鼠體重影響與健康對照組小鼠平均體重(22.64±1.18)g相比，模型組小鼠體重(22.03±0.26)g，較健康對照組相比增長緩慢(P<0.05)，炎癥高峰階段出現零增長、負增長。統計學分析，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。α-GalCer組平均體重(22.59±0.78)g，CH2b組平均體重(22.38±0.34)g。α-GalCer組、CH2b組小鼠相比模型組緩慢上升，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，但兩組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

2.2CH2b對RA模型小鼠關節紅腫情況的影響不同處理組之間足踝腫脹與緩解程度不同，模型組小鼠造模第8天開始，一個或幾個足趾出現紅腫，逐日加重，第14天到達高峰，表現為多關節紅腫，伴足掌、足踝腫脹，此后日漸緩解。α-GalCer組、CH2b組足踝不同程度的腫脹，均比同期模型組程度輕，利用系統評分法對小鼠關節紅腫程度進行量化可以明顯看出各組差異(圖2、3)。

2.3CH2b對關節部位炎癥浸潤情況的影響HE染色后顯微鏡下觀察發現，與健康對照組無炎細胞浸潤情況相比，GPI誘導的模型組小鼠的骨與骨、骨與上皮之間的結締組織存在大量的炎細胞浸潤，其中，單核細胞較多，漿細胞和淋巴細胞量少。α-GalCer組、CH2b組，炎細胞浸潤情況減輕，炎細胞數量也相對較少(圖4)。

2.4CH2b對iNKT細胞頻率變化的影響健康對照組iNKT細胞頻率值為(0.39～0.03)%；RA模型組iNKT細胞頻率為(0.10～0.71)%；α-GalCer組頻率值為(1.36～0.18)%；CH2b組為(1.22～0.19)%。α-GalCer組和CH2b組之間比較差異無統計學意義(P>0.05),其他各組之間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

2.5CH2b對炎性細胞因子水平的影響與健康對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平升高，在炎癥高峰期上升最明顯(P<0.05)。α-GalCer、CH2b組與模型組相比，TNF-α、IL-6、IFN-γ水平相對降低，在造模第14天降低最明顯(P<0.05)。IL-4變化差異無統計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖1　各組小鼠體重變化情況Fig.1　Change of weight in mice

圖2　各組小鼠關節紅腫狀況Fig.2　Swelling of ankle joint in mice

圖3　各組小鼠足踝關節腫脹狀況評分Fig.3　Clinical score of ankle joint in mice

圖4　第14天各組小鼠關節組織HE染色對比圖(×100)Fig.4　Histopathological changes of ankle joint in mice on day 14(×100)

圖5　各組小鼠外周血iNKT細胞頻率Fig.5　Frequency of iNKT cells in peripheral blood in mice

圖6　各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平Fig.6　Levels of TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ in serum in mice

3　討論

RA是由自身抗原誘導T、B 細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞和滑膜細胞等參與免疫應答、釋放炎癥細胞因子介導的滑膜炎癥、軟骨侵蝕和關節損傷。RA個體內存在明顯的免疫功能紊亂和T細胞亞群失衡：Th1、Th17亞群過度增殖，Th2、Treg亞群被抑制[11]。恒定NKT 細胞(invariant NKT cells，iNKT cells)表達恒定的TCRα鏈和某些β鏈(小鼠是由恒定的Vα14-Jα18和限制性的Vβ8.2,-7或-2鏈，人類為Vα24-Jα18和Vβ11鏈)，主要通過APC表面MHCⅠ樣分子CD1d遞呈的糖脂類抗原(如經典的激活劑α-GalCer)激活[12]。α-GalCer是一種從海洋生物海綿體中提取出來的脂類物質，通過與CD1d、TCR形成三聯體活化iNKT細胞，迅速分泌大量細胞因子和趨化因子，參與機體的免疫應答，或維持免疫耐受[9]。研究發現，iNKT細胞與RA發病密切相關[5,6]。

GPI是臨床RA診斷及判斷活動性的一個常用檢測指標，rhGPI抗原可誘導DBA1小鼠發生與人RA病變特點相似的關節炎癥[10]。最新研究發現，該模型小鼠表現出iNKT細胞頻率降低[13]，Th1和Th17炎性細胞因子過度分泌等特點[14]。

在本實驗中，我們以構建GPI 混合肽段誘導的模型小鼠為基礎，著重探討免疫調節劑CH2b通過iNKT細胞對GPI誘導的RA模型小鼠的干預作用。研究結果顯示：CH2b在炎癥初期即開始抑制小鼠關節紅腫，在模型組到達炎癥高峰前，CH2b組已經開始大幅逆轉炎癥進展；HE染色觀察發現，與模型組大量炎細胞浸潤不同，CH2b、α-GalCer組炎細胞數量明顯減少；炎癥高峰期，FACS顯示：CH2b上調iNKT的頻率；血清炎性細胞因子TNF-α、IL-6水平較模型組下降。Horikoshi等[9]研究證明，α-GalCer對GPI誘導的關節炎有治療作用。本實驗中，免疫調節劑CH2b與α-GalCer達到了相似的治療效果：體重上調、關節腫脹緩解、關節組織間炎性細胞浸潤減輕、炎癥高峰期iNKT細胞頻率上調、TNF-α及IL-6水平降低等。α-GalCer對自身免疫病的潛在治療作用已在動物模型中得到確認[14，15]。但是，Parekh等[16]發現，具有超強激活力的α-GalCer可以刺激所有iNKT細胞充分活化，致使大量的Th1、Th2及Th17型因子同時釋放，形成“細胞因子風暴”；而過度活化之后細胞就會長時間處于無活性狀態。這種超抗原樣的特性限制了α-GalCer的臨床應用。因此，探索與α-GalCer激活特性不同的溫和而有效的iNKT細胞激動劑成為人們的研究熱點。Kerzerho等[17]報道，能降低與恒定TCR間親和力或iNKT/APC相互作用時間的調節劑可以有助于延長iNKT細胞的壽命，保持其在體內的活化狀態。我們前期合成的免疫調節劑CHs是將免疫調節劑匹多莫德所含有的特征基團——噻唑烷酮與糖類分子連接后篩選出的小分子糖類化合物，并研究了其對T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞的影響[6,8,18-22]，發現在體外實驗中CHs能顯著促進T細胞增殖、iNKT細胞增殖和殺靶活性，提升巨噬細胞功能，降低IFN-γ/IL-4 比值，使iNKT分化傾向Th2優勢，具有全面的免疫調節活性，且對細胞無毒副作用。在本實驗中CH2b在RA小鼠體內不僅發揮了與α-GalCer相似的治療效果，而且除關節及相關免疫組織器官病理改變外，心、肺、腎、腦、膽囊、膀胱、睪丸、附睪、腎上腺均未見明顯異常，提示CH2b腹腔注射后不引起其他器官的毒性反應，是一種相對理想的iNKT細胞功能調節劑。雖然免疫調節劑CH2b調節iNKT細胞具體機制還需進一步探討，但其具有的糾正體內免疫平衡紊亂的潛在作用，使得將來應用CH2b基于iNKT細胞靶向治療RA成為了可能。

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[收稿2015-10-28修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Effects of immunostimulator CH2b on mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis

LIU Jia-Lin，ZHANG Xue-Jiao，YANG Fei，LOU Yong-Fu，MENG Ming，CHEN Dong-Zhi.College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China

Objective:To explore the effect of the synthetic immunomodulator CH2b with a thiazolidin-4-one ring on the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA) mice induced by glucose-6-phosphate isomerase(GPI) mixed peptides.Methods: hGPI325-339,hGPI469-483 peptide fragments were mixed with complete freund′s adjuvant fully,DBA/1 mice were givien subcutaneous injection of the emulsifiers,pertussis toxin to strengthen immunity.And then RA mice were intervened with α-GalCer and CH2b,the changes of body weight,ankle joint symptoms scores were observed.The joint tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) was used to evaluate the inflammatory cells.Fluorescence-activated cell sorting(FACS) was used to detect the frequency changes of iNKT cells.Cytometric bead array(CBA) was used to analyze the levels of serum cytokines TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ.Results: Compared with the model group,α-GalCer,CH2b could reduce the inflammation of the model mice,significantly improve the body weight growth and the joint swelling(P<0.05).The inflammatory cells infiltration were decreased.More importantly,CH2b improved the frequency of iNKT cells in peak,the difference was statistically significant(P<0.05).The levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ in serum were significantly decreased(P< 0.05) by CH2b.α-GalCer,CH2b could decrease the levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ,and the two groups had no statistically significant difference(P> 0.05).Conclusion: Immunomodulator CH2b by activating iNKT cells affect the secretion of inflammatory cytokines,and it relieved the GPI induced arthritis.

Immunostimulator CH2b;α-GalCer;Glucose-6-phosphate isomerase;iNKT cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.002

R392.5文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1094-05

③，E-mail:mengming127@163.com；E-mail:chenddzz@163.com。

劉嘉琳(1978年-)，女，博士，講師，主要從事疾病動物模型的建立及發病機制的研究，同時就職于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，E-mail:liujialin7867@126.com。