小鼠γδ T細胞亞群在不同組織器官的分布特性及在感染后的變化①

胡　淵　李　燕　關　妘　張　彩

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所,濟南250012)

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小鼠γδ T細胞亞群在不同組織器官的分布特性及在感染后的變化①

胡淵李燕關妘張彩

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所,濟南250012)

①本文受國家重點基礎研究發展計劃(973)項目(2013CB944901)和國家自然科學基金項目(81273220, 81472646, 91442114)資助。

目的：關注不同γδ T細胞亞群在各組織器官的分布特點及在鼠傷寒沙門氏菌腸道感染中的變化，為探討γδ T細胞組織學分布的生理學意義和在感染性疾病中的作用提供依據和新的思路。方法：采用流式細胞術與PCR技術檢測胸腺、脾臟、淋巴結、肝臟、皮膚以及小腸上皮內淋巴細胞中γδ T細胞及其不同亞群的比例；通過PMA與離子霉素體外刺激，流式細胞術檢測不同組織γδ T細胞分泌細胞因子IFN-γ與IL-17a的差異；通過灌胃建立鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型，流式細胞術檢測肝臟與小腸上皮內淋巴細胞中不同γδ T細胞亞群比例的變化。結果：γδ T細胞富含于小腸上皮內、皮膚與肝臟中，而在胸腺、脾臟與淋巴結中比例較低。不同亞群在各組織器官中的分布存在較大差異，皮膚主要存在Vγ5+γδ T細胞亞群，小腸中主要存在Vγ1+、Vγ4+與Vγ7+γδ T細胞亞群。肝臟γδ T細胞主要分泌IL-17a，而小腸上皮內γδ T細胞主要分泌IFN-γ。在鼠傷寒沙門氏菌腸道感染時，小腸上皮內γδ T細胞的比例明顯升高，其中Vγ1+γδ T細胞比例升高更為顯著；肝臟總γδ T細胞比例無顯著變化，但Vγ1+γδ T細胞比例降低，Vγ4+γδ T細胞比例明顯升高。結論：γδ T細胞富含于小腸、皮膚與肝臟中，且其不同亞群具有組織分布特異性。不同組織的γδ T細胞產生細胞因子的能力存在較大差異。鼠傷寒沙門氏菌感染時，小腸與肝臟γδ T細胞亞群的分布變化也存在較大差異。

γδ T細胞；組織分布；鼠傷寒沙門氏菌

T細胞在胸腺發育的早期發生TCR基因重排，形成具有巨大多樣性特征的TCR庫。根據T淋巴細胞表達TCR的不同，可以將T淋巴細胞分成兩類，即表達αβ TCR的T細胞(αβ T細胞)和表達γδ TCR的T細胞(γδ T細胞)。γδ T細胞是固有免疫細胞的重要組成之一，在免疫防御、免疫監視及某些疾病(例如人類獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤和自身免疫性疾病等)的進程中扮演重要角色。多項研究表明，γδ T細胞在腸黏膜屏障抵抗病原菌的過程中發揮重要作用，在感染數小時內，即可快速、準確地遷移至受感染部位，殺傷受感染的上皮細胞，抑制病原菌的侵襲[1,2]。

γδ T細胞是一群異質性的細胞群體，根據其TCR γ或δ鏈使用的不同，將其分為多個亞群。從發現γδ T細胞至今，有多個命名系統被應用。這里我們采用Heilig與Tonegawa命名法則[3]對小鼠γδ T細胞進行分類。與αβ T細胞類似，γδ T細胞的發育過程中需要進行TCR基因重排，編碼TCRγ鏈的基因座上含有V、J、C基因片段。早期研究發現小鼠TCRγ基因包含7個V基因片段，但由于與V3基因片段進行重排的J3與C3基因片段是假基因[4]，故不存在Vγ3Jγ3Cγ3鏈。因此，根據γ鏈使用的不同，可將小鼠γδ T細胞分為6個亞群，分別為Vγ1+、Vγ2+、Vγ4+、Vγ5+、Vγ6+和Vγ7+γδ T亞群。簡單來說，Vγ1+γδ T細胞主要發揮抑炎作用[5,6]，而Vγ4+γδ T細胞主要發揮促炎作用[5]，Vγ5+γδ T細胞主要分布于皮膚，對于皮膚創傷的修復起重要作用[7]；Vγ7+γδ T細胞主要分布于小腸，對于腸道穩態的維持、免疫監視與病原菌的清除發揮關鍵作用[2]。目前，針對γδ T細胞發育與功能的研究相對較多，但是對于不同γδ T細胞亞群的組織分布特性未見詳細系統的研究報道。因此本研究主要關注不同γδ T細胞亞群在各組織器官的分布特點及在鼠傷寒沙門氏菌腸道感染后的變化，以期為γδ T細胞的組織分布及在感染等相關疾病中的作用提供依據和新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1菌株鼠傷寒沙門氏菌，購自ATCC，編號14028。

1.1.2實驗動物C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3試劑FITC標記的γδ TCR抗體、Vγ1抗體、Vγ4抗體和Vγ5抗體，PerCP-Cy5.5標記的CD3e抗體，APC標記的γδ TCR抗體，均購自Biolegend公司。內標用固定穿膜試劑盒購自美國BD公司。離子霉素和佛波酯(Pbolmyristate acetate，PMA)購自Sigma公司。布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)購自碧云天公司。Trizol試劑和M-MLV反轉錄酶購自Invitrogene公司。Taq DNA聚合酶購自全式金公司。膠原酶Ⅱ購自Gibco公司。Percoll液購自GE Healthcare公司。分離小腸上皮內淋巴細胞所需的消化液配方為1 000 ml三蒸水中加入8 g NaCl、0.4 g KCl、0.152 g Na2HPO4·12H2O、0.06 g KH2PO4、0.175 g NaHCO3、1 g葡萄糖、1 mmol/L EDTA及1 mmol/L DTT。

1.1.4儀器流式細胞儀FACS Calibar，美國BD公司；普通PCR儀，Bio-Rad公司；離心機Centrifuge 5810R，Eppendorf公司；凝膠成像儀，Alphalmager公司。

1.2實驗方法

1.2.1肝臟單個核細胞的分離摘眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，剪下肝臟，用PBS清洗干凈后剪碎肝組織，經200目金屬篩網研磨過濾后，700 r/min離心1 min，收集上層液體，棄沉淀。再1 200 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。經40% Percoll液2 500 r/min密度梯度離心25 min后，留沉淀，棄上層液體。細胞沉淀中加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，再經PBS洗滌后，即得肝臟單個核細胞。

1.2.2小腸上皮內淋巴細胞的分離處死小鼠，取出小腸，除去黏連的結締組織，沖洗腸腔并將小腸外翻。將小腸剪成約1 cm的小段，放入10 ml消化液中，37 ℃，180 r/min振蕩40～45 min。振蕩完畢后，用尼龍柱和紗布進行過濾，收集濾液，1 200 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。用3 ml 40% Percoll液懸起細胞沉淀，將其疊加到2 ml 70% Percoll液上，1 800 r/min梯度密度離心20 min后，吸取白色云霧狀中間層細胞，再經PBS洗滌后，即得小腸上皮內淋巴細胞。

1.2.3皮膚淋巴細胞的分離剪取腹部及背部皮膚組織，剪去鼠毛及脂肪組織。將皮膚剪成小塊，放入5 ml 含2 mg/ml膠原酶Ⅰ的PBS中，37℃，110 r/min振蕩2 h。經200目金屬篩網過濾后，再1 200 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。用4 ml 40% Percoll液懸起細胞沉淀，將其疊加到4 ml 70% Percoll液上，2 200 r/min梯度密度離心25 min后，吸取白色云霧狀中間層細胞，再經PBS洗滌后，即得皮膚淋巴細胞。

1.2.4脾臟、胸腺與淋巴結單個核細胞的分離摘眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，剪下脾臟、胸腺與腹股溝淋巴結，用PBS清洗干凈后剪碎，分別經200目金屬篩網研磨過濾后，1 200 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，即得胸腺和淋巴結單個核細胞。脾臟細胞再經紅細胞裂解液裂解，PBS洗滌后，即得脾臟單個核細胞。

1.2.5流式細胞術檢測細胞表面標志將提取的細胞加入大鼠血清進行封閉，4℃，30 min。分別加入相應稀釋的熒光抗體，4℃避光染色30 min。加入PBS離心洗滌，除去未結合的抗體，加入適量PBS懸起細胞沉淀，上機檢測。

1.2.6胞內細胞因子的檢測將細胞沉淀重懸于含10%新生牛血清的RPMI1640完全培養基中，接種于12孔板內，加入終濃度為30 ng/ml PMA與1 μg/ml離子霉素，37℃ 5%CO2孵育1 h后加入終濃度為10 ng/ml 的BFA，繼續孵育3 h。收集細胞，經PBS洗滌后，加入大鼠血清封閉，加入外標抗體染色，避光，室溫染色1 h。胞內固定穿膜按BD公司試劑盒說明書的步驟執行，加入內標抗體，經洗滌后，懸起細胞，上機檢測。

1.2.7半定量RT-PCR檢測不同Vγ鏈的表達Trizol法提取細胞總RNA，按M-MLV試劑說明書的步驟進行逆轉錄。按下列條件進行PCR擴增：94℃ 30s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，38個循環后，72℃ 10 min，擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由于TCRγ鏈轉錄時會發生TCR基因重排，通常6個V基因與J或D基因的重排組合是Vγ1Jγ4Cγ4、Vγ2Jγ2Cγ2、Vγ4Jγ1Cγ1、Vγ5Jγ1Cγ1、Vγ6Jγ1Cγ1、Vγ7Jγ1Cγ1[8]。PCR檢測不同TCRγ鏈的引物組合策略見表1，引物序列見表2。

1.2.8鼠傷寒感染模型的建立采用灌胃方式建立鼠傷寒腸道感染模型[9]。鼠傷寒沙門氏菌的灌胃劑量是1×105CFU/只，空白對照組給予相同體積的LB培養基(0.2 ml)。

1.3統計學處理實驗結果用GraphPad Prism 5軟件進行統計，采用方差分析檢驗各組均數間差異的顯著性，組間比較選用t檢驗，以P<0.05表示差異具有顯著性。

2　結果

2.1不同組織器官γδ T細胞的比例檢測我們首先用流式細胞術分別檢測了成年小鼠胸腺、脾臟、淋巴結、肝臟、皮膚及小腸上皮內淋巴細胞中γδ T細胞的比例。如圖1所示，胸腺、脾臟、淋巴結、肝臟、皮膚及小腸上皮內淋巴細胞中γδ T細胞的比例分別是0.18%±0.06%、0.67%±0.15%、0.63%±0.08%、1.81%±0.33%、9.36%±6.01%和34.10%±12.94%。肝臟、皮膚與小腸中γδ T細胞的比例明顯高于其他免疫器官，差異有顯著性。

表1　引物組合策略Tab.1　Primer combination strategy

2.2不同γδ T細胞亞群的組織分布我們利用流式細胞術與PCR技術分別檢測了胸腺、脾臟、肝臟、皮膚與小腸中γδ T細胞亞群的分布。由于只能買到商品化抗Vγ1、Vγ4與Vγ5的單抗，所以我們通過流式細胞術檢測了這三個亞群在不同器官的分布。同時結合PCR技術，檢測了各器官中Vγ1、Vγ2、Vγ4、Vγ5、Vγ6與Vγ7的表達。流式細胞術檢測結果顯示，分布于小腸的γδ T細胞主要以Vγ1和Vγ4亞群為主，皮膚組織的γδ T細胞以Vγ5亞群為主(圖2A)。PCR的結果顯示，小腸IEL中γδ T細胞除Vγ1和Vγ4表達較高(與流式細胞術檢測結果一致)外，Vγ7表達水平很高(與文獻報道一致)，胸腺與脾臟只表達Vγ1、Vγ2和Vγ4，而肝臟Vγ1～Vγ7均有表達(圖2B)。PCR結果基本與流式細胞術檢測的結果一致，并可補充流式細胞術不能檢測的亞群情況。

表2　引物序列Tab.2　Primer sequence

圖1　流式細胞術檢測各臟器中γδ T細胞的比例Fig.1　Flow cytometry detects proportion of γδ T cells in various tissues

圖2　流式細胞術及PCR技術檢測γδ T細胞亞群的組織分布Fig.2　Flow cytometry and PCR technique analyzes distributions of different γδ T cell subsetsNote: A.FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in various tissues;B.PCR technique detects expression of Vγ1-Vγ7 mRNA in various tissues.

圖3　流式細胞術檢測不同部位γδ T細胞分泌的細胞因子Fig.3　Flow cytometry analyzes cytokine secretions of γδ T cells in various tissuesNote: A.FACS analyzes cytokine secretion of liver γδ T cells;B.FACS analyzes cytokine secretions of γδ T cells in various tissues.

2.3不同部位γδ T細胞分泌細胞因子的差異小鼠γδ T細胞按分泌細胞因子IFN-γ與IL-17能力的不同可以分為4個亞群：IFN-γ+γδ T細胞(又稱γδ T1細胞)、IL-17+γδ T細胞(又稱γδ T17細胞)、雙陰的γδ T細胞與雙陽的γδ T細胞。通過PMA與離子霉素的體外刺激，流式細胞術檢測胞內細胞因子的分泌(圖3)，我們發現肝臟γδ T細胞分泌細胞因子的能力最強，且以分泌IL-17a為主(圖3B)。脾臟γδ T細胞分泌IFN-γ與IL-17a的能力相當(圖3B)，胸腺γδ T細胞以分泌IL-17a為主(圖3B)，而IEL中γδ T細胞以分泌IFN-γ為主，幾乎檢測不到IL-17a的分泌(圖3B)。

圖4　流式細胞術檢測傷寒感染后小腸與肝臟中γδ T細胞亞群的分布變化Fig.4　FACS analyzes distribution changes of various γδ T cell subsets in liver and small intestine after Salmonella typhimurium infectedNote: A.3 days after Salmonella typhimurium infected,FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in IEL;B.5 days after Salmonella typhimurium infected,FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in liver.

2.4傷寒感染后不同組織γδ T細胞亞群分布變化已有研究表明，γδ T細胞在免疫防御、免疫監視與某些疾病(例如病原菌感染[2]、腫瘤[10]與乙肝[11,12]等)的進程中扮演重要角色。為了探討γδ T細胞在病理狀態下不同亞群分布的變化，我們選用了鼠傷寒沙門氏菌腸道感染模型進行研究。流式細胞術檢測結果顯示，傷寒感染第3天時，感染組小腸IEL中γδ T細胞比例明顯高于未感染對照組(P<0.05，圖4A)。其中Vγ1+γδ T細胞亞群比例明顯高于對照組(P<0.05，圖4A)，Vγ4+與Vγ5+γδ T細胞亞群比例未見明顯變化(P>0.05，圖4A)。傷寒感染第5天時，肝臟γδ T細胞比例未見明顯差異(P>0.05，圖4B)，但Vγ1+γδ T細胞比例明顯下降(P<0.05，圖4B)，Vγ4+γδ T細胞比例顯著升高(P<0.05，圖4B)。

3　討論

胸腺是T細胞分化、發育的主要場所。αβ T與γδ T細胞來源于共同的前體細胞——淋巴樣前體細胞。由于其表面不表達CD4與CD8分子，又將這群細胞稱為DN細胞。根據其表面CD44和CD25分子的表達，將DN細胞分為4個階段：DN1(CD44+CD25-)、DN2(CD44+CD25+)、DN3(CD44-CD25+)和DN4(CD44-CD25-)。DN細胞在DN3階段經歷一系列有序的TCR基因重排與表達，決定其分化方向。如果DN細胞進行Tcrb基因座重排，其會向αβ T細胞發育，而進行Tcrg、Tcrd基因座重排，其會向γδ T細胞發育。在胚胎時期，γδ T細胞就開始在胎胸腺內進行發育，并逐漸發育成熟，遷出胸腺至外周。

本研究發現，γδ T細胞富含于小腸、皮膚與肝臟中，在淋巴結、脾臟或胸腺中含量較低。小腸、皮膚與肝臟的一個共同特點是易于接觸外界抗原或病原菌，以天然免疫占優勢。我們發現，不同γδ T細胞亞群在這些器官中的分布具有差異性。小腸主要以Vγ1+、Vγ4+與Vγ7+γδ T細胞亞群為主，皮膚主要以Vγ5+γδ T細胞亞群為主，而肝臟中所有6個亞群均能檢測到。在成年小鼠胸腺中檢測不到Vγ5+、Vγ6+與Vγ7+γδ T亞群的存在，提示這三個亞群在成年小鼠個體中可能不是在胸腺內發育成熟的。已有研究表明，γδ T細胞存在胸腺外發育的現象，Vγ7+γδ T亞群可能是在小腸中發育而來的[13]，而肝臟亦可能是胸腺外發育的器官之一[14]。那么是否存在這樣的一個可能：在成年個體內，肝臟作為γδ T細胞胸腺外發育分化的場所，源源不斷地維持著部分γδ T細胞亞群的更新。但是，由于肝臟獨特的結構特點，有利于免疫細胞的駐留，所以不能排除肝臟中存在的γδ T細胞亞群是從其他器官遷移而來并在肝臟駐留的可能性。

γδ T細胞除了殺傷功能外，另一個重要的功能是分泌多種細胞因子，如IFN-γ、IL-17與TNF-α等[15]。通過胞內細胞因子的檢測，我們發現，肝臟γδ T細胞分泌細胞因子的能力最強，且以分泌IL-17a為主；而小腸γδ T細胞分泌細胞因子的能力較弱，主要分泌IFN-γ。肝臟為具有免疫耐受特點的器官，其雖然能夠通過腸系膜靜脈接受腸道來源的大量外來抗原與微生物產物，卻不引起嚴重的炎癥應答。肝臟與小腸γδ T細胞接觸相似的抗原刺激，產生細胞因子的能力卻截然不同，這可能與γδ T細胞在其中發揮的功能不同相關。研究表明，小腸上皮內γδ T細胞在抵抗腸道外來病原體感染過程中發揮關鍵的保護作用，并參與保護腸黏膜的完整性、維持腸道微環境的穩態[9,16]。而肝臟γδT細胞是產生IL-17最為豐富的細胞，在HBV慢性持續性感染和肝癌模型均發現肝臟γδT細胞通過分泌IL-17誘導局部產生CXCL5，招募MDSC至炎癥或腫瘤部位，通過誘導CD8+T細胞耗竭，參與維持HBV誘導的或腫瘤微環境的免疫耐受[10,11]。結合文獻與我們的結果，我們推測，腸道γδ T細胞主要通過殺傷功能和分泌IFN-γ發揮重要的免疫監視作用，而肝臟γδ T細胞主要通過分泌IL-17a等細胞因子在維持肝臟局部免疫耐受中發揮關鍵作用。不同γδ T細胞亞群具有組織分布特異性，其在不同的組織部位及在不同的疾病模型中亦可能發揮不同的功能。通常認為，Vγ1+γδ T細胞具有抑炎作用，清除該亞群可增強小鼠對李斯特菌的清除能力[17]。研究發現，該亞群主要通過殺傷活化的巨噬細胞來控制炎癥進程[18]。然而，Vγ4+γδ T細胞卻對巨噬細胞具有活化作用，可促進巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6與IL-10等細胞因子的能力[19]。在病毒介導的心肌炎模型中，也發現該亞群具有促進炎癥的作用[20]。本研究發現，在傷寒感染時，腸道與肝臟γδ T細胞亞群的分布發生明顯不同的變化，在感染第3天，小腸上皮內總的γδ T細胞的比例明顯升高，尤其是Vγ1+γδ T細胞比例升高，而Vγ4+與Vγ5+γδ T細胞無變化，顯示此時小腸γδ T細胞處于抑制炎癥的狀態。在感染第5天時，肝臟總的γδ T細胞比例雖無明顯變化，但Vγ1+γδ T細胞比例下降，Vγ4+γδ T細胞比例升高，呈現了一種促進炎癥的狀態。小腸與肝臟中γδ T細胞變化的差異是否與不同組織γδ T細胞特性、傷寒感染的程度或免疫應答的進程相關還有待下一步的研究。

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[收稿2015-10-29修回2016-01-05]

(編輯倪鵬)

Distinct distributions of mouse γδ T cells in various tissues and changes after infection

HU Yuan,LI Yan,GUAN Yun,ZHANG Cai.Institute of Immunopharmacology and Immunotherapy,School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University,Ji′nan 250012,China

Objective:The study focuses on the distinct distributions of γδ T cells in various tissues and the changesafterSalmonellatyphimuriuminfection,and attempts to explore the physiological significance of γδ T cell distribution and the role of γδ T cells in infectious diseases.Methods: Flow cytometry and PCR technique were used to detect the proportion of different γδ T cell subsets among thymus,spleen,lymph nodes,liver,skin,and intestinal intraepithelial lymphocytes.Flow cytometry was applied to detect the secretion of IFN-γ and IL-17a.The changes of various γδ T cell subsets in liver and intestinal intraepithelial lymphocytes were analyze afterSalmonellatyphimuriuminfection.Results: γδ T cells were rich in the intestinal epithelium,skin and liver,but poor in the thymus,spleen and lymph nodes.The distribution of different subsets was quite dissimilar.Vγ5+γδ T cells chiefly existed in skin,and Vγ1+,Vγ4+,Vγ7+γδ T cells largely existed in small intestine.γδ T cells in liver mainly secreted IL-17a;however,γδ T cells in intestinal intraepithelial secreted IFN-γ.After infection by Salmonella typhimurium,the proportion of γδ T cells in intestinal intraepithelial increased significantly,particularly Vγ1+γδ T cells.In Liver,there was no significant change of total γδ T cell ratio,but the ratio of Vγ1+γδ T cells reduced,Vγ4+γδ T cells raised.Conclusion: γδ T cells are rich in the intestinal epithelium,skin and liver.The distribution of different subgroups has specificity.There are large differences in the ability of cytokine secretion among various subgroups of γδ T cells.The distribution of γδ T cell subgroups in small intestine and liver changes duringSalmonellatyphimuriuminfection.

γδ T cells;Tissue distribution;Salmonellatyphimurium

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.005

R392.12文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1107-06

胡淵(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事肝臟免疫學研究，E-mail:huyuan_tx@163.com。

及指導教師：張彩(1965年-)，女，教授，博士生導師，主要從事天然免疫和肝臟免疫學研究，E-mail:caizhangsd@sdu.edu.cn。