HSP70-TKD誘導的NK細胞向腫瘤細胞遷移的實驗研究①

汪相如　陳蓉明　龔福生　應敏剛　鄭秋紅

(福建醫科大學教學醫院福建省腫瘤醫院腫瘤分子研究室，生物治療重點實驗室，福州350014)

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HSP70-TKD誘導的NK細胞向腫瘤細胞遷移的實驗研究①

汪相如陳蓉明龔福生應敏剛鄭秋紅

(福建醫科大學教學醫院福建省腫瘤醫院腫瘤分子研究室，生物治療重點實驗室，福州350014)

①本文為福建省醫學創新課題(2011-CX-17)。

目的：研究HSP70-TKD誘導的自然殺傷細胞(NK)體外對細胞表面HSP70表達不同的胰腺癌細胞和結腸癌細胞的遷移作用差異。方法：用干細胞培養基富集人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天加入2 μg/ml TKD，4 d后用流式細胞儀檢測NK細胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達情況；應用流式分選將胰腺癌細胞系Colo357和結腸癌細胞系CW2分為HSP70高表達細胞亞系Colo+、CW2+和HSP70低表達細胞亞系Colo-、CW2-；Transwell小室實驗檢測HSP70-TKD誘導的NK細胞對這4種細胞的遷移能力，MTT法檢測HSP70-TKD誘導的NK細胞對這4種細胞的殺傷活性。結果：流式結果顯示NK細胞在干細胞培養基中培養14天可大量增殖，細胞純度最高達(92.50 ±1.25)%； 經HSP70-TKD誘導后，NK細胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達明顯增加；經流式分選后，Colo+、Colo-細胞表面HSP70的表達分別為(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,而CW2+、CW2-細胞表面HSP70的表達分別為(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%；HSP70-TKD誘導的NK細胞對Colo+遷移率為(68.6±2.8)%，明顯高于對Colo-的遷移率(22.8±1.5)%，NK細胞對CW+遷移率為(73.5±2.7)%，明顯高于對CW2-的遷移率(18.2±1.3)%；HSP70-TKD誘導的NK細胞對Colo+、Colo-的殺傷活性有顯著性差異，當效靶比為20∶1時，殺傷活性分別為(61.2±3.0)%、(24.5 ±1.5)%， NK對CW2+、CW2-的殺傷活性有顯著性差異，當效靶比為20∶1時，殺傷活性分別為(63.8±3.2)%、(22.4±1.8)%。結論：HSP70-TKD誘導的NK細胞是一種新型、高效的免疫活性細胞，在體外易向HSP70表達陽性的腫瘤細胞遷移。

腫瘤細胞；HSP70-TKD;NK細胞；遷移

自然殺傷細胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T 、B 淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞,分布于外周各淋巴器官及血液循環系統,無需抗原的預先刺激與活化即可發揮細胞毒效應,并可分泌多種細胞因子及趨化因子。NK細胞不表達TCR或產生抗體，其細胞表達一系列活化性受體及抑制性受體,兩者間的平衡是控制NK 細胞是否被激活的重要機制，當活化性受體與相應的配體結合，細胞處于殺傷活化狀態，而當抑制性受體與相應的配體結合，細胞處于抑制狀態[1,2]。NK細胞表面的抑制性受體與自體細胞表達的MHCⅠ類分子結合，因此不會殺傷自體細胞，而可殺傷丟失MHCⅠ類分子的腫瘤細胞[3]。多種腫瘤細胞表面表達HSP70,原發胰腺癌細胞有64%細胞表面表達HSP70,而相應的正常組織卻不表達HSP70[4]。在體外，細胞表面表達的HSP70為NK細胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的配體，其中C末端的14個氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(TKD)是暴露在腫瘤的細胞外介質中,是CD94/NKG2C與HSP70的結合位點[5,6]。本課題的前期實驗發現HSP70-TKD誘導的NK細胞對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且NK細胞能浸潤到HSP70高表達的胰腺組織。本文是從體外研究NK細胞對細胞表面HSP70表達不同的腫瘤細胞的遷移作用差異,從而探討這種遷移作用的機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑淋巴細胞分離液由中國醫學科學院研究所提供。干細胞培養基(Stem cell growth medium，SCGM)購自德國CellGro 公司，IL-2 購自上海華新公司，PHA購自華美公司,鼠抗人CD3-FITC、CD56-PE、CD94-FITC、Anti-HSP-70/FITC(2 mg/ml) 購自上海瑞齊生物科技有限公司，RPMI1640培養基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Gibco公司,HSP70-TKD 由晶美公司合成，純度>95%，5 μm孔徑有基底膠Transwell小室購自BD公司。

1.1.2細胞株人胰腺癌細胞Colo357和人結腸癌細胞CW2購自上海細胞所。

1.2方法

1.2.1NK細胞的擴增及表型分析采集健康人外周血10 ml，肝素抗凝，PBS 等倍稀釋后，用淋巴細胞分離液以密度梯度離心法分離單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用SCGM(含5%人AB 血清及600 U/ml IL-2)調整PBMC 密度至1×106/ml，接種于6 孔板，2 ml /孔，加入500 ng/ml鼠抗人CD3 單抗和50 μg/ml PHA，置37 ℃、5%CO2培養箱培養。培養3 d 后，3 000 r/min離心4 min(離心半徑10 cm)，洗去培養基中的鼠抗人CD3 單抗和PHA，再加入SCGM 繼續培養，每3天半量換液。細胞培養14 d 后用流式細胞儀分析細胞的表型特征，1×106個細胞加入10 μl CD3-FITC和CD56-PE，室溫暗處結合20 min后，PBS 洗滌2次，用500 ml 的PBS 懸浮細胞，流式細胞儀檢測CD3/CD56 表達情況[7]。

1.2.2HSP70-TKD誘導NK細胞表面CD94/NKG2C的表達按照以上的方法培養NK細胞至第10天時，將細胞分成誘導組和未誘導組，誘導組加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，未誘導組加入100 U/ml的IL-2，4 d后流式細胞儀檢測NK細胞表面CD94/NKG2C的表達，1×106個細胞分別加入10 μl CD94-FITC，室溫暗處結合20 min后，PBS 洗滌2 次，用500 ml的PBS 懸浮細胞，流式細胞儀檢測CD94/NKG2C 表達情況。

1.2.3流式細胞分選HSP70陽性的腫瘤細胞處于對數期的人胰腺癌細胞Colo357和人結腸癌細胞CW2經胰酶消化，PBS洗滌2次，用PBS將細胞的濃度調到107個/ml，取500 μl的細胞懸液加入50 μl的Anti-HSP-70/FITC，靜置4 ℃冰箱，避光，孵育30 min，PBS洗滌2次,通過細胞濾網后用流式細胞儀檢測并分選HSP70+和HSP70-細胞群,流式分選陽性的HSP70+和HSP70-細胞后進行回測，檢測HSP70+的百分比。

1.2.4Transwell小室檢測NK細胞對HSP70+和HSP70-細胞群的遷移能力將孔徑為5 μm的基底膠Transwell小室放入24孔培養板中，上室加入300 μl預溫的無血清培養基， 室溫下靜置15～30 min，使基質膠水化，再吸去剩余培養液。分別將2×105個細胞表面HSP70表達陽性的Colo+、CW2+和細胞表面HSP70表達陰性的Colo-、CW2-細胞懸浮在600 μl含10%血清的1640培養基中，接種在Transwell小室的下室中，置于培養箱培養48 h。將2×106個經HSP70-TKD誘導的NK細胞懸浮在1 ml的培養基，在Transwell小室上室中加入100 μl的NK細胞懸液，于5%CO2培養箱與下室的腫瘤細胞共同孵育，4 h后收集下室的細胞，加入PBS至100 μl，100 μl未加入小室的NK細胞和所收集100 μl下室的細胞加入1 μl CD56-PE和 CD94-FITC，室溫暗處結合20 min后，PBS 洗滌2次，用100μl PBS 懸浮細胞，流式細胞儀檢測CD56+CD94+的細胞數,NK細胞遷移率=下室CD56+CD94+細胞數/加樣的CD56+CD94+細胞數[8，9]。

1.2.5NK細胞對細胞表面HSP70+和HSP70-的腫瘤細胞的殺傷以上述方法培養NK 細胞到10d時， 加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，誘導4 d后的細胞為效應細胞，以Colo+、Colo-、CW2+、CW2-細胞為靶細胞(效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)，同時設靶細胞組、效應細胞組和RPMI1640 空白對照組，37℃、5% CO2培養12 h。然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，吹打，混勻，用酶標儀檢測570 nm 波長處光密度(A)值，計算其殺傷率。

2　結果

2.1NK細胞的擴增及表型分析從10例志愿獻血者外周血單個核細胞中富集、擴增NK細胞，流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞的純度，結果表明，按照1.2.1的實驗方法， NK細胞能明顯擴增，NK細胞平均擴增950倍，擴增后CD3-CD56+NK細胞的百分比率最高值為(92.50 ±1.25)%,最低值為(78.36±0.82)%,取純度的最高NK細胞作為以下各個實驗用的細胞。結果見表1。

2.2HSP70-TKD誘導NK細胞表面CD94/NKG2C的表達當細胞培養至第10天時，加入100 U/ml IL-2 和2 μg/ml TKD，經HSP70-TKD誘導后，NK細胞細胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達量顯著明顯增加，較IL-2組和TKD組分別增加(223.45±7.56)%和(205.33±4.80)%，結果見圖1。

2.3流式細胞分選HSP70陽性的腫瘤細胞人胰腺癌細胞Colo357和人結腸癌細胞CW2經流式分選后得到HSP70高表達的細胞株Colo+、CW2+和低表達的細胞株Colo-、CW2-，流式細胞儀回測各個細胞群的細胞表面HSP70的表達，結果見圖2和圖3，Colo+、Colo-細胞表面HSP70的表達分別為(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,差異有統計學意義(P<0.05);而CW2+、CW2-細胞表面HSP的表達分別為(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1　健康人外周血NK細胞的擴增倍數及細胞純度Tab.1　Amplification times and percentage of NK cell from PBMC in blood donor

圖1　HSP70-TKD誘導的NK細胞CD94/NKG2C的表達Fig.1　CD94/NKG2C expression levels on NK cells induced with HSP70-TKDNote: *.P<0.05 vs IL-2 group and TKD group.

圖2　流式分選人胰腺癌細胞HSP70表達不同的細胞Fig.2　Cell line Colo357 was separated into Colo+ and Colo- with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05 vs Colo- group.

圖3　流式分選人結腸癌細胞CW2細胞表面HSP0表達不同的細胞群Fig.3　Cell line CW2 was separated into CW2+ and CW2-with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2- group.

圖4　NK細胞向HSP70表達不同的胰腺癌細胞群遷移Fig.4　NK cell migrate to human pancreatic cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs Colo- group.

圖5　NK細胞向HSP70表達不同的結腸癌細胞群遷移Fig.5　NK Cell migrate to human colon carcinoma cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2-group.

表2　HSP70-TKD誘導的NK細胞對HSP表達不同的腫瘤細胞的殺傷(%)Tab.2　Cytolytic activity against tumor cells with different HSP70 expression by NK cells induced by HSP70-TKD(%)

2.4Transwell小室檢測HSP70-TKD誘導的NK細胞對HSP70+和HSP70-細胞群的遷移能力Transwell小室實驗結果見圖4和圖5，NK細胞對Colo+、Colo-的遷移率分別為(68.6±2.8)%、(22.8±1.5)%，差異有統計學意義(P<0.05)，對CW2+、CW2-的遷移率分別為(73.5±2.7)%、(18.2±1.3)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5HSP70-TKD誘導的NK細胞對胰腺癌細胞和結腸癌細胞的殺傷以誘導4 d后的NK細胞效應細胞，以Colo+、Colo-CW2+、CW2-細胞為靶細胞(效靶比分別為5∶1、10∶1、20：1、40∶1),結果見表2,結果表明，NK細胞在IL-2和TKD同時作用下，其對胰腺癌細胞Colo+的殺傷明顯高于對Colo-的殺傷作用。結果見表2，當效靶比為10∶1其殺傷率已達到(50.5±2.5)%，明顯高于Colo-組細胞的(22.5±1.2)%,當效靶比為40∶1時Colo+組殺傷率高達到(71.6±3.2)%，明顯高于Colo-組細胞的(32.0±2.3)%， NK細胞對胰腺癌Colo+細胞和Colo-胞的殺傷率差異有統計學意義(P<0.01)。NK細胞對結腸癌細胞CW2+的殺傷明顯高于對CW2-殺傷作用,當效靶比為40∶1時CW2+組殺傷率高達到(73.2±3.5)%，明顯高于CW2-組細胞的(30.5±2.2)%， NK細胞對結腸癌CW2+細胞和CW2-細胞的殺傷率差異有統計學意義(P<0.01)。

3　討論

自然殺傷細胞(NK細胞)是免疫系統中非常重要的一類細胞毒性淋巴細胞，是免疫系統中的第一道防線。NK細胞是一群特殊的細胞，它不同于獲得性免疫在發揮功能的時候是需要抗體和主要組織相容性復合體(MHC)。在哺乳類動物受到病毒感染或者腫瘤侵襲的時候，NK細胞會非常迅速地產生反應。NK細胞表面表達多種抑制受體和活化受體，通過這兩類受體的平衡來調控NK細胞的功能。正常情況下，抑制受體通過與自身MHCⅠ類分子結合抑制NK細胞的活性，產生自身耐受；當有異源刺激時，活化受體與配體結合，產生激活信號，并下調NK細胞表面抑制受體的表達，使NK細胞活化[10，11]。某些腫瘤細胞表面特異性表達HSP70，而腫瘤細胞表面的HSP70能夠被NK 細胞表面活化型CD94 /NKG2C 受體所識別而誘導NK 細胞的殺傷活性。TKD 是HSP70 的表面抗原決定位， 與全長HSP70 一樣能夠激活NK 細胞殺傷細胞膜HSP70 表達陽性的腫瘤細胞[12]。NK細胞的遷徙不依賴于細胞與細胞之間的接觸，在體外NK細胞的遷徙是由可溶性的細胞因子和趨化因子如TNF-α、 IL-2等誘導的。用TKD 和低劑量的IL-2直接誘導外周血單核細胞，誘導后NK細胞表面的殺傷性受體CD94/NKG2C表達顯著增加。本項目的前期研究表明CD94+的NK細胞能明顯抑制HSP70陽性的胰腺癌移植瘤且腫瘤組織有大量的NK細胞浸潤，說明CD94+的NK細胞與HSP70和HSP70-TKD存在著相互作用。本研究Transwell小室實驗表明腫瘤細胞分泌的可溶性因子HSP70相關的多肽(包括TKD)是NK細胞向HSP70陽性的腫瘤細胞遷徙的誘導因素，CD94+的NK細胞能識別HSP70陽性的腫瘤細胞并向它浸潤。在NK細胞的胞漿里有很多溶細胞顆粒，當NK細胞活化時，會釋放穿孔素(Perforin)和顆粒酶(Granzyme)等溶細胞蛋白，從而殺傷靶細胞。因此NK細胞在HSP70-TKD誘導下，其對細胞HSP70陽性腫瘤的殺傷活性明顯增加。 在熱療和化療的過程中必然會使腫瘤細胞表面的HSP70表達增加，其對HSP70-TKD 誘導NK 細胞的敏感性也隨之增強。因此，腫瘤患者如果在化療和熱療同時配合HSP70-TKD 誘導的NK細胞進行綜合治療可提高療效。

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[收稿2015-10-26修回2016-04-07]

(編輯許四平)

·啟事·

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《中國免疫學雜志》編輯部

Experimental study of HSP70-TKD induced NK cells migrated toward tumor cells

WANG Xiang-Ru，CHEN Rong-Ming，GONG Fu-Sheng，YING Min-Gang， ZHENG Qiu-Hong.Department of Tumor Molecular Biology，Fujian Tumor Research Institute，Fujian Provincial Cancer Hospital，Teaching Hospital of Fujian Medical Unniversity,the Key Laboratory of Biotherapy,Fuzhou 350014，China

Objective:To investigate the Migration ability toward human pancreatic carcinoma cell line and human colon carcinoma cell line with difference HSP70 plasma membrane expression.Methods: CD3-CD56+NK cells were obtained from human peripheral blood mononuclear(PBMC)in stem cell growth medium SCGM，2 μg/ml TKD was added to the medium on 10th day,the activating receptor CD94/NKG2C expression levels on NK cells was detected with FAC after 4 days.The human pancreatic carcinoma cell line Colo357 and the human colon carcinoma cell line CW2 were separated into Colo+and CW2+with high HSP70 expression and Colo-and CW2-with low HSP70 expression;Migration assays of NK to the four difference cell lines were performed in a Transwell cell culture system.The cytolytic activity of TKD-activated NK cells against the four subline with HSP70 expression on their cell surface was analyzed by MTT assay.Results: Flow cytometry analysis showed that CD3-CD56+NK cells could expanded after 2 weeks in SCGM medium,and the largest percentage of NK cell was (92.50 ±1.25)%.CD94 expression levels on NK cells increased obviously after TKD inducement the cell surface HSP70 expression of Colo+,Colo-were (78.2±2.2)% and (27.3±1.2)% separately,the cell surface HSP70 expression of CW2+，CW2-were (91.1±2.5)% and (18.2±1.0)% separately after FACS;the Migration of NK cells toward Colo+was (68.6±2.8)%,higher than the migration toward Colo-with (22.8±1.5)%;the Migration of NK cells toward CW2+was(73.5±2.7)%,higher than the migration toward CW2-with (18.2±1.3)%;the cytolytic activity of NK against Colo+was(61.2±3.0)% compared to (24.5 ±1.5)% against Colo-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1,the cytolytic activity of NK against CW2+was (63.8±3.2)% compared to (22.4±1.8)% against CW2-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1.Conclusion: TKD-activated NK cells are highly efficient cytolytic effector cells which have stronger significant migration toward HSP70-positive tumor target cells on their cell surface in vitro .

Tumor cells;HSP70-TKD;NK cells;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.008

R392.12文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1123-05

汪相如(1971年-)，男，主管技師，主要從事腫瘤免疫學的研究。

及指導教師：鄭秋紅(1962年-)，女，主任醫師，主要從事腫瘤免疫治療的研究，E-mail:zqh2858@foxmail.com。