生脈注射液聯合去甲腎上腺素對多器官功能障礙綜合征大鼠淋巴細胞凋亡及凋亡蛋白的影響

楊　玲　尹春元　呂　欣　張貴晨

(北京市昌平區醫院重癥醫學科，北京102200)

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生脈注射液聯合去甲腎上腺素對多器官功能障礙綜合征大鼠淋巴細胞凋亡及凋亡蛋白的影響

楊玲尹春元呂欣張貴晨①

(北京市昌平區醫院重癥醫學科，北京102200)

①北京市朝陽醫院外科重癥監護一病區，北京100020。

目的：研究生脈注射液聯合去甲腎上腺素對多器官功能障礙綜合征大鼠細胞免疫的影響。方法：選取40只健康雄性大鼠，通過應用酵母多糖腹腔注射致MODS模型，采用數字表法隨機分為對照組、生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及生脈注射液聯合去甲腎上腺組， 每組10只。用藥后6、24、48 h檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-12和IL-2的濃度，免疫組化檢測大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9活性，流式細胞技術測定淋巴細胞凋亡情況及Th1/Th2。結果：①與對照組相比，生脈注射液組、去甲腎上腺組以及聯合用藥組，TNF、IL-1β濃度上升不是很明顯，且隨著治療時間的延長，治療各組TNF、IL-1β濃度逐漸下降，聯合用藥組TNF、IL-1β基本趨于正常；而IL-12、IL-2趨勢則相反，治療各組較對照組血清IL-12、IL-2濃度明顯升高，聯合用藥組升高更加明顯。②與對照組相比，生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及聯合用藥組caspase-3、caspase-8、caspase-9表達均顯著減少，且聯合用藥組凋亡蛋白的表達下降更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。③生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及聯合用藥組淋巴細胞凋亡的陽性細胞數比率較對照組明顯減少，聯合用藥組淋巴細胞凋亡的陽性細胞數減少較生脈注射液組以及去甲腎上腺素組更明顯；相比于對照組，生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及聯合用藥組Th1/Th2 比率明顯增高，聯合用藥組增高更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：生脈注射液聯合去甲腎上腺素對多器官功能障礙大鼠具有減輕炎癥反應和改善免疫功能的作用。

多器官功能障礙；生脈注射液；去甲腎上腺素；免疫功能

多器官功能障礙綜合癥(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是指機體遭受嚴重感染、創傷、休克、大手術等損害24 h后，同時或序貫發生兩個或兩個以上器官或系統功能不全或衰竭的臨床綜合征，是重癥監護病房(Intensive care unit，ICU)患者發病和死亡的一個重要原因。MODS的發病率高、預后差，在ICU成年患者中的發生率為11%～40%，是當今外科ICU病房首要的死亡原因，約占50%～80%[1]，在我國MODS的病死率超過60%[2]。目前對于MODS的了解，認為它是一種連續的生理紊亂狀態，但具體的發病機制尚未完全明了。近些年來，國內外學者關于MODS免疫系統損傷的研究，發現患者病程早期大量免疫細胞的過度反應致使炎癥反應失衡，從而誘發全身炎癥反應綜合征(SIRS)；而在病程后期， 由于免疫細胞過度損耗及功能的變化又引起免疫防御系統的嚴重損傷，發展為免疫抑制或免疫麻痹，最終導致MODS[3-5]。因此關于MODS的免疫失衡與調節機制，已成為當前MODS與創傷醫學研究中的重要課題。

生脈注射液主要有效成分為紅參、麥冬、五味子3味中藥，具有益氣養陰，復脈固脫功能。臨床上主要用于治氣陰兩虧、脈虛欲脫的四肢厥冷、汗出、心悸、氣短、心肌梗死、感染性休克等具有上述癥狀的臨床病理狀態。由于生脈注射液的廣泛應用，對其藥理作用的實驗研究亦得到了許多學者的重視。研究發現，生脈注射液具有保護缺血再灌注細胞、減少心肌細胞凋亡等功能。另外學者段順元等[6]研究發現，生脈注射液可降低糖尿病腎病患者血清的TNF-α、IL-6 水平，且TNF-α、IL-6 的降低與24 h尿蛋白量的降低及療效呈正相關。提示生脈注射液可抑制患者炎性細胞因子的產生，并具有免疫調節功能和消炎作用。這些研究表明，生脈注射液對機體的免疫狀態以及免疫細胞的功能及凋亡有一定影響。基于這些研究，本實驗通過構建MODS模型大鼠，研究生脈注射液對MODS大鼠的免疫功能的影響。

1　材料與方法

1.1材料μ-Quant 酶標分光光度儀(美國 Bio-Tek公司)、ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，caspase-3、caspase-8和caspase-9多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，二抗為生物素標記羊抗小鼠IgG(Santa Cruz 公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型構建健康雄性SD大鼠40只，體質量240～280 g，由華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供，符合國家醫用動物使用標準(許可證號：SCXK[鄂]2012- 2014，級別：SPF)。參照并改良陳德暉等“二次打擊”方法和標準制備MODS大鼠模型[7]：采用左眼球取血2 ml/100 g，4 h后以5 mg/kg腹腔注射LPS。對照組予以腹腔注射等量的生理鹽水。建模后，隨機分為對照組、生脈注射液組(2 ml/只)、去甲腎上腺素組(3 mg/kg)、生脈注射液(2 ml/只)及去甲腎上腺素(3 mg/kg)聯合用藥組，每組10只。靜脈分別應用相應藥物，分別于6、24、48 h將動物腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 ms/kg)麻醉后，常規消毒皮膚，對應時間點摘眼球眼底動脈取血，EP管采集，靜置30 min，離心(3 000 r/min，15 min)分離血清，-20℃貯存。脫臼處死小鼠，分離脾臟，剪取部分入無菌、無酶凍存管，超低溫冰箱保存備用；部分石蠟包埋，冰凍后切冰凍切片，-70℃保存；部分用10%中性甲醛溶液固定，用于組織形態學觀察；其余用于提取T淋巴細胞。

1.2.2炎性細胞因子檢測采用 ELISA(酶聯吸附法)檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-12 和IL-2的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.3脾臟caspase-3、caspase-8和caspase-9活性檢測采用免疫組織化學染色法檢測。將脾臟石蠟切片分別脫蠟、內源性過氧化物酶封閉后，分別滴加caspase-3、caspase-8和 caspase-9多克隆抗體(滴度1∶100)，PBS代替一抗做陰性對照。40℃過夜后滴加二抗(滴度1∶200)，DAB顯色。采用彩色病理圖像分析系統對切片進行圖像分析。

1.2.4淋巴細胞凋亡檢測取無菌脾臟粉碎處理，經400目不銹鋼篩網過濾制成單細胞懸液，按20 μl/107細胞的量，加入抗小鼠T細胞微磁珠分選T淋巴細胞。按凋亡試劑盒說明書標記淋巴細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡，操作方法按照試劑說明書。

1.2.5淋巴細胞亞群檢測取上述分選出的T淋巴細胞懸浮液，同時采用CD4、CD8和IFN-γ抗體結合FITC熒光標記檢測收集的血液標本中的Th1細胞；CD4、CD8和IL-4抗體結合PE熒光標記檢測收集的血液標本中的Th2細胞。

2　結果

2.1MODS模型大鼠癥狀和體征腹腔注射內毒素后，各組動物相繼出現煩躁、流涎、稀便、呼吸增快，最后出現活動抑制、呼吸減慢及尿少等MODS的表現。實驗動物大鼠脾臟病理變化見圖1。

2.2各組大鼠不同時間點血清各細胞因子的濃度用藥前檢測各組大鼠血清細胞因子，各組細胞因子濃度無明顯差異。與對照組相比，生脈注射液組、去甲腎上腺組以及聯合用藥組，TNF、IL-1β濃度上升不是很明顯，且隨著治療時間的延長，治療各組TNF、IL-1β濃度逐漸下降，聯合用藥組TNF、IL-1β基本趨于正常；而IL-12、IL-2趨勢則相反，治療各組較對照組血清IL-12、IL-2濃度明顯升高，聯合用藥組升高更加明顯。結果見圖2。

2.3各組淋巴細胞凋亡的情況以及Th1/Th2比率比較生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及聯合用藥組淋巴細胞凋亡的陽性細胞數比率較對照組明顯減少，聯合用藥組淋巴細胞凋亡的陽性細胞數減少較生脈注射液組以及去甲腎上腺素組更明顯；相比于對照組，生脈注射液組、去甲腎上腺素組以及聯合用藥組Th1/Th2 比率明顯增高，聯合用藥組增高更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1　MODS大鼠各時相脾臟的病理變化(HE，×200)Fig.1　Pathological changes in spleen 6h,24h,48h after induction of MODS in rats (HE,×200)Note: A.MODS 6 h;B.MODS 24 h;C.MODS 48 h.

圖2　各組大鼠不同時間點血清各細胞因子的濃度Fig.2　Plasma concentration of TNF,IL-1β，IL-12，IL-2 in 0 h,6 h,24 h,48 h after treatment in MODS rats

表1　各組大鼠脾臟凋亡蛋白檢測Tab.1　Expression of caspase-3,caspase-8,caspase-9 in each group

表2　各組大鼠淋巴細胞凋亡的陽性細胞數比較(個/400倍野)以及Th1/Th2 比較(%)Tab.2　Lymphocyte number of positive apoptosis and Th1/Th2 ratio in each group(%)

3　討論

MODS是臨床常見的急危重癥，發病率有逐年上升的趨勢，是ICU的一個主要死亡原因，近20年來的研究顯示，MODS的病死率仍高達70%左右[8]，成為現代危重病醫學中的重點和焦點問題。由于MODS發病的確切機制尚未完全闡明，因此對其發病機制的研究一直是國內外研究的熱點，研究者從不同角度提出了MODS的發病假說，主要有缺血- 再灌注損傷假說[9]、內毒素假說[10]、胃腸道假說[11]、炎癥失控假說[12]、免疫失衡學說[13]，二次打擊學說[14]、代償性抗炎反應學說[15]等，炎癥機制以及免疫失衡的探討一直成為研究 MODS 的熱點。

生脈注射液以紅參、麥冬為主要原料提煉而成。早期研究發現，生脈注射液主要用于改善心血管疾病，具有保護心肌細胞、減少心肌細胞凋亡、防止心肌鈣超載等療效[16]。最近學者研究發現，生脈注射液能夠調節癌癥患者的免疫功能[17]。生脈注射液對晚期癌癥化療患者具有保護和增強免疫功能的作用。其主要是通過調節患者體內各種與免疫相關的細胞因子的水平，從而調節免疫功能，保護心、腎、肝等主要臟器的功能。另外有學者發現生脈注射液能抑制促炎因子的產生以及促進抗炎因子的產生，從而維持機體炎性因子的動態平衡，避免機體損傷引起的全身炎癥反應[18]。

基于以上這些研究，本實驗通過構建MODS大鼠模型，觀察生脈注射液對MODS大鼠免疫功能的影響。根據ELISA、IHC以及流式細胞術結果發現，早期炎癥因子TNF、IL-1β在MODS明顯高表達，而生脈注射液能明顯抑制機體產生這些炎癥因子，生脈注射液聯合去甲腎上腺素抑制作用更明顯，從而減輕MODS引起機體的損傷以及免疫功能的紊亂。而生脈注射液能夠促進機體分泌T細胞活化相關因子IL-2和抗原呈遞細胞活性相關因子IL-12，從而使機體活化的免疫狀態轉化為免疫抑制和活化共存的狀態，從而避免免疫活化狀態時對機體各臟器的損傷[19]。

MODS引起的炎性反應早期，大量促炎因子能夠引發淋巴細胞的凋亡，導致凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9等大量凋亡蛋白激活。本研究發現MODS大鼠脾臟凋亡蛋白的含量與脾臟淋巴細胞的凋亡結果是一致的。我們發現當給予大鼠去甲腎上腺素、生脈注射液以及聯合兩者使用時，脾臟凋亡蛋白的含量明顯減少，相應的淋巴細胞凋亡的數量，以及Th1/Th2比率的升高，聯合用每組藥組均能改善機體免疫細胞的數量以及蛋白含量的增加。并且這些結果的改善是隨著治療時間的增加而逐步變化的。這一結果與早前學者研究發現炎癥因子能夠調節Th1/Th2的比率從而調節淋巴細胞凋亡，并且調節機體的反應是一致的。我們的研究發現生脈注射液組和聯合用藥組通過調節免疫和機體炎癥因子動態的平衡，從而促進Th1/Th2的平衡，減少淋巴細胞的凋亡以及凋亡蛋白的激活，進而進一步減輕機體的炎癥反應，改善機體的免疫功能[20]。

綜上所述，生脈注射液可以減輕MODS大鼠的炎癥反應，并且改善MODS的免疫能力。臨床上去甲腎上腺素作為MODS基礎用藥，本研究發現當在使用去甲腎上腺素的基礎上，聯合應用生脈注射液能明顯改善MODS大鼠的免疫狀態以及免疫細胞的凋亡，從而調節大鼠體內的細胞免疫。這一結果提示我們MODS臨床患者在基礎應用去甲腎上腺素的同時輔助應用生脈注射液可以改善患者機體的免疫狀態，從而有利于MODS患者的恢復。

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[收稿2015-09-18修回2015-10-16]

(編輯倪鵬)

Effect of Shengmai injection combined with norepinephrine on apoptosis of lymphocyte and apoptosis protein in MODS rats

YANG Ling,YIN Chun-Yuan,Lü Xin,ZHANG Gui-Chen.Department of ICU,Beijing Changping Hospital,Beijing 102200,China

Objective:To study the effect of the Shengmai injection combined with norepinephrine on cellular immunity in rats with multiple organ dysfunction syndrome.Methods: 40 healthy male rats were randomly divided into the control group,the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group of 10 rats in each group after MODS rat model were established by intraperitoneal injection of zymosan.The plasma level of TNF-α，IL-1β，IL-12 and IL-2 were detected by ELISA,and the protein expression of caspase-3,caspase-9 and caspase-8 in spleen were tested by IHC during 6 h,24 h,48 h.And the lymphocyte number of apoptosis and the ratio of Th1/Th2 were tested by flow cytometry.Results: ① Compared with the control group,the plasma concentrations of TNF and IL-1β were not significant increased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,as the extension of treatment time,the plasma concentration of TNF and IL-1β were significant lower in treatment groups than control group .While the plasma concentration of IL-12 and IL-2 were significantly increased in treatment groups,and the combined treatment group was more obvious.② Compared with control group,the protein expression of caspase-3,caspase-9 and caspase-8 in spleen were decreased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,and the combined treatment group was more obvious.③ The lymphocyte number of positive apoptosis were significantly decreased,and the Th1/Th2 ratio were increased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,and the combined treatment group was more obvious.Conclusion: The Shengmai injection combined with norepinephrine can reduce the inflammatory reaction and improve the immune function in the rat with multiple organ dysfunction.

MODS；Shengmai injection；Norepinephrine；Immunity

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.010

R392.9文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1133-05

楊玲(1980年-)，女，主治醫師，主要從事感染性休克、危重癥產科、多臟器功能不全等相關疾病的診治工作，E-mail：yangling2876@163.com。

及指導教師：尹春元(1966年-)，男，主任醫師，主要從事感染性休克合并多臟器功能不全、重癥胰腺炎等相關疾病的研究，E-mail：yinchunyuan29@163.com。