鼻咽癌MKK4蛋白表達與-1044A/T多態性的相關性分析①

魯明騫　孔慶志　許新華　盧宏達　趙華山　周　剛　徐冰清　郭　蓉

(三峽大學第一臨床醫學院腫瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民醫院腫瘤內科，宜昌443000)

?

鼻咽癌MKK4蛋白表達與-1044A/T多態性的相關性分析①

魯明騫孔慶志②許新華盧宏達②趙華山周剛徐冰清郭蓉

(三峽大學第一臨床醫學院腫瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民醫院腫瘤內科，宜昌443000)

①本文為湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB675)、湖北省教育廳重點項目(D20141205)和2012年宜昌市科技研究與開發項目(A12301-03)。

②武漢市中心醫院&武漢市腫瘤研究所，武漢430061。

目的：探討鼻咽癌組織中MKK4蛋白的表達與-1044A/T多態性的相關性。方法：90例鼻咽癌患者，運用免疫組化法測定MKK4蛋白的表達，以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)檢測其基因-1044A/T位點單核苷酸多態性。結果：鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(-)為24.4%(22/90)，(+)為15.6%(14/90)，(++)為34.4%(31/90)，(+++)為25.6%(23/90)。低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發生T基因變異無統計學意義(Z=0.323,P=0.747)。結論：MKK4蛋白表達的高低與-1044A/T啟動子基因多肽性無明顯相關性。

鼻咽癌；MKK4蛋白；1044A/T；多態性

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)好發于我國南方各省，世界上80%的鼻咽癌患者發生在中國，占頭頸部惡性腫瘤的首位[1]。鼻咽癌的發生受多重因素的影響，其中信號傳導在鼻咽癌的發生和發展中具有重要的作用，MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)作為絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號傳導通路的組成部分，在受到外界因素刺激后，能將細胞外信號傳導至細胞內，對腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡和轉移等有一定的調節作用[2-4]。單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)在惡性腫瘤的發病、治療與預后等方面的研究是目前的熱點，目前關于MKK4啟動子區-1044A/T多態性與鼻咽癌的關系尚未見相關報道，本研究將探討鼻咽癌MKK4蛋白的表達與其啟動子區1044A/T多肽性的關系，為鼻咽癌的早期發現、早期診斷和早期治療等提供一種分子理論依據。

1　材料與方法

1.1一般資料收集2009年1月至2014年12月我院鼻咽癌患者90例，其中男性54例、女性36例，年齡22～73歲，平均年齡(45.3±5.2)歲。病理科有完整的石蠟組織標本，同時抽取患者外周靜脈血2 ml待測。

1.2方法

1.2.1將石蠟組織標本制備成4 μm厚的連續切片，經脫蠟、水化、高溫高壓抗原修復后，滴加MKK4單克隆抗體(1∶80) (購于杭州華安生物技術有限公司)，4℃過夜，37℃復溫45 min，PBS洗滌2 min，共3次，滴加生物素化二抗，37℃ 20 min，PBS洗滌2 min，共3次，加試劑SABC，37℃作用20 min，PBS洗滌5 min，共4次，加用DAB顯色劑，然后在顯微鏡下進行觀察。陰性對照以PBS代替。

1.2.2MKK4基因-1044A/T基因型測定采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)測定MKK4-1044A/T (rs3809728)的基因型，外周靜脈血2 ml，離心(10 000 r/min×10 min)后取白細胞的沉淀，用QIAGEN公司的FlexiGene DNA kit試劑盒提取凍血DNA，提取樣本500 μl，稀釋至20～30 ng/L。自設上游引物為5′-TTGGGTTTGG AACAAGAAGG-3′(forward)，下游引物為5′-CAGCCTTGCCTAAAATGGAA-3′(reverse)。起始高溫變性(94℃×5 min)，35個循環適溫延伸(94℃×30 s)，低溫退火(72℃×60 s)，最后擴增階段(72℃×10 min)。用核酸內切酶TSP509 I消化擴增好的片段(65℃過夜)，然后置于2% 瓊脂糖凝膠分離，隨機選取2個SNP位點提純片段10%的片段進行測序確定效果。

1.3統計學方法所有數據用SPSS13.0統計軟件進行分析處理。采用直接計數法計算基因型及等位基因頻率。如果方差不齊，采用兩獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

免疫組化結果表明，MKK4蛋白在鼻咽癌組織中陰性表達率為24.44%(22/90)，陽性表達率為75.56%(68/90)，其中(+)為14人，占15.56%，(++)為31人，占34.44%，(+++)為23人，占25.56%。低表達(-/+)共36例(40%)，高表達(++/+++)共54例(60%)。見圖1、表1。

通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)檢測鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型。采用核酸內切酶Sml I處理后，-1044TT基因型共產生了70 bp和152 bp兩條帶，-1044AA基因型產生了分子量為222 bp一條帶，而雜合子共產生了70、152和222 bp三條帶(見圖2)。所有的結果均由經驗豐富的實驗者采用單盲法評價，隨機選取2個SNP位點提純片段10%的片段進行測序確定效果。其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。見表2。

90例鼻咽癌患者中，低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發生T基因變異無統計學意義。Z=0.323,P=0.747，見表3。

表1　MKK4蛋白在鼻咽癌組織的表達Tab.1　MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma

表2　鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型情況Tab.2　Distribution of patients with nasopharyngeal carc-inoma SNP -1044A/T

圖1　MKK4的免疫組化切片Fig.1　Immunohistochemical analysis of MKK4Note: A.Nasopharyngeal carcinoma tissue;B.Chronic inflammation nasopharyngeal tissue.

表3　1044A/T基因型與蛋白表達的關系Tab.3　1044A/T relationship with expression of differe-nt genotypes

圖2　MKK4 -1044A>T 基因擴增產物凝膠電泳結果Fig.2　Result of PCR-RFLP for MKK4 -1044A T gene

3　討論

鼻咽癌是頭部最常見的惡性腫瘤，好發于我國及東南亞國家，尤其以廣東省最多見，發病率達20/10萬～30/10萬，而歐洲、北美洲和大洋洲國家的發病率較低，低于1/10萬[1]。鼻咽癌的發生與EB病毒感染、化學和遺傳因素等有關，由于這些細胞外信號的刺激，可激活蛋白激酶，如MAPK、蛋白激酶C、蛋白激酶A、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CAMK)等等。目前研究認為MAPK信號傳導通路是最重要的蛋白激酶信號傳導通路之一，而MKK4作為MAPK信號傳導通路的重要組成部分，可能是多種上游致癌應激信號途徑的匯聚點，是癌基因Ras信號傳導通路的中心環節，對細胞的增殖、炎癥反應、細胞凋亡起著非常重要的調節作用[5]，能同時磷酸化并激活JNK通路和p38通路。MKK4蛋白的表達高低與多種惡性腫瘤惡性程度相關[6-8]，有研究認為MKK4在胃癌中表達越高，其無復發生存及總生存率越低[9]，但有學者在乳腺癌及胰腺癌的研究中，卻得到了相反的實驗結果[10，11]。本研究的結果顯示，鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(-)為24.44%(22/90)，(+)為15.56%(14/90)，(++)為34.44%(31/90)，(+++)為25.56%(23/90)，低表達(-/+)共36例(40%)，高表達(++/+++)共54例(60.00%)，前期結果研究發現在有淋巴結轉移、分化程度較差的組織中的MKK4蛋白的表達率明顯低于無淋巴結轉移、分化程度相對較好的組織，具有統計學差異(P<0.05)[12]。

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)是由于單個堿基的轉換、缺失和插入，導致的在不同個體間的可檢測的DNA序列中單個堿基的差異[13]。癌基因、抑癌基因、基質金屬蛋白酶、細胞因子及其受體等相關基因的SNP變化均與惡性腫瘤有著明顯的相關性，而這些多態性的研究最常見的是關于基因啟動子區域的探索。目前研究發現MDM2 SNP309T/G、Fas-SNP 1377G/A和FasL-SNP 844T/C、SNP-1298A/C、1304A/T等基因多態與鼻咽癌的發病風險相關，特別是在早期及吸煙患者中更明顯[14-16]。而SNP-139 GG、-939 AA和-1082 A/G多態性與鼻咽癌的遺傳易感性相關[17]。Farhat等[18]在-18啟動子SNP-607 C/A 和-137 G/A多態性研究發現其多態性的變化對鼻咽癌的發生和發展具有重要的促進作用。本研究通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)檢測90例鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型，其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。MKK4蛋白低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發生T基因變異無統計學意義(Z=0.323,P=0.747)。本研究發現對于多態性位點-1044AT,攜帶-1044AA、-1044AT及-1044TT各基因型鼻咽癌患者與MKK4蛋白表達含量的差別無統計學意義。

[1]Chen L,Hu CS,Chen XZ,etal.Concurrent chemoradiotherrapy plus adjuvant chemotherapy versus cencurrent chemotherapy alone in patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma:A plus 3 multicentre randomised controlled trial[J].Lancet Oncol,2012,13(2):163-171.

[2]魯明騫，孔慶志.絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路在惡性腫瘤中的研究現狀[J].實用癌癥雜志,2013,28(3):320-321.

[3]魯明騫，許新華.MKK4與惡性腫瘤相關性的研究進展[J].山東醫藥,2011,51(19):110-111.

[4]Wuestefeld T,Pesic M,Rudalska R,etal.A Direct in vivo RNAi screen identifies MKK4 as a key regulator of liver regeneration[J].Cell,2013,153(2):389-401.

[5]Whitmarsh AJ,Davis RJ.Role of mitogen-activated protein kinase kinase 4 incancer[J].Oncogene,2007,26(22):3172-3184.

[6]An J,Liu H,Magyar CE,etal.Hyperactivated JNK is a therapeutic target in pVHL-deficient renal cell carcinoma[J].Cancer Res,2013,73(4):1374-1385.

[7]Khamis ZI,Iczkowski KA,Sang QX.Metastasis suppressors in human benign prostate,intraepithelial neoplasia,and invasive cancer:their prospects as therapeutic agents[J].Med Res Rev,2012,32(5):1026-1077.

[8]Divya SP,Wang X,Pratheeshkumar P,etal.Blackberry extract inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation through MAP kinases and NF-κB signaling pathways in SKH-1 mice skin[J].Son YOToxicol Appl Pharmacol,2015,284(1):92-99.

[9]Coleman MP,Quaresma M,Berrino F,etal.Cancer survival in five continents:a worldwide population-based study (CONCORD)[J].Lancet Oncol,2008,9(8):730-756.

[10]Huang MJ,Wang PN,Huang J,etal.Differential expression patterns of metastasis suppressor proteins in basal cell carcinoma[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2013,93(10):746-750.

[11]Wu CW,Li AF,Chi CW,etal.Human gastric cancer kinase profile and prognostic significance of MKK4 kinase[J].Am J Pathol,2000,56(6):2007-2015.

[12]魯明騫，孔慶志，許新華，等.MKK4蛋白在鼻咽癌組織中的表達與臨床意義[J].中國免疫學雜志,2015,31(9):1235-1238.

[13]Taylor JL,Szmulewitz RZ,Lotan T,etal.New paradigms for the function of NKK1/MKK4 in controlling growth of disseminated cancer cells[J].Cancer Lett,2008,272(1):12-22.

[14]Sousa H,Pando M,Breda E,etal.Role of the MDM2 SNP309 polymorphism in the initiation and early age of onset of nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Carcinog,2011,50(2):73-79.

[15]Cao Y,Miao XP,Huang MY,etal.Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL and risk of nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Carcinog,2010,49(11):944-950.

[16]Cao Y,Miao XP,Huang MY,etal.Polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase are associated with a high risk of nasopharyngeal carcinoma in a smoking population from Southern China[J].Mol Carcinog,2010,49(11):928-934.

[17]Xu YF,Liu WL,Dong JQ,etal.Sequencing of DC-SIGN promoter indicates an association between promoter variation and risk of nasopharyngeal carcinoma in cantonese[J].BMC Med Genet,2010,11(161):1186-1471.

[18]Farhat K,Hassen E,Bouzgarrou N,etal.Functional IL-18 promoter gene polymorphisms in Tunisian nasopharyngeal carcinoma patients[J].Cytokine,2008,43(2):132-137.

[收稿2015-10-20修回2016-03-17]

(編輯張曉舟)

Correlation between MKK4 protein expression and -1044A/T polymorphism in Nasopharyngeal carcinoma

LU Ming-Qian,KONG Qing-Zhi,XU Xin-Hua,LU Hong-Da,ZHAO Hua-Shan,ZHOU Gang,XU Bing-Qing，GUO Rong.Three Gorges University Oncology Institute,the First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Department of Oncology,Yichang Central People′s Hospital,Yichang 443000,China

Objective:Discussion MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and -1044A/T polymorphism correlation.Methods: 90 patients with nasopharyngeal carcinoma,MKK4 protein expression was determined by immunohistochemical staining,polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) to detect the gene -1044A/T sites monocytes nucleotide polymorphism.Results: MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma (-) was 24.4% (22/90),(+) was 15.6% (14/90),(++) was 34.4% (31/90),(+++) was 25.6% (23/90).Low expression (-/+) patients with a total of 36 cases,-1044AA genotype accounted for 22 cases (61.11%),AT genotype accounted for 12 cases (33.33%),TT genotype accounted for two cases (5.56%),AT + TT gene type accounted for 14 cases (38.89%).The patients with high MKK4 expression of 54 cases,of which accounted for 38 cases of AA genotype (70.37%),AT genotype accounted with 15 cases (27.78%),TT genotype accounted for one case (1.85%),AT + TT genotype accounted for 16 cases (29.63%).Low expression and high expression of T gene mutation occurs no significant (Z=0.323,P=0.747).Conclusion: MKK4 protein expression correlated with -1044A/T gene promoter polymorphisms was no significant correlation.

Nasopharyngeal carcinoma;MKK4 protein;1044A/T；Polymorphism

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.011

R739.62文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1137-04

魯明騫(1973年-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腫瘤中西醫結合臨床及基礎研究。

及指導教師：孔慶志(1952年-)，男，教授，博士生導師，主要從事腫瘤中西醫結合臨床及基礎研究。