哮喘患兒外周血巨噬細胞M1/M2極化狀態研究

陳　娜　龐保東

(唐山市婦幼保健院兒內科,唐山063000)

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哮喘患兒外周血巨噬細胞M1/M2極化狀態研究

陳娜龐保東

(唐山市婦幼保健院兒內科,唐山063000)

目的：體外培養哮喘患兒外周血巨噬細胞，并從細胞的表型和功能方面觀察巨噬細胞M1/M2極化狀態的變化，從而探討巨噬細胞在哮喘發病中的作用。 方法：選取50例健康對照者與50例哮喘患兒，收集哮喘患兒及健康對照組的血液，分離純化得到巨噬細胞，體外給予10 ng/ml GM-CSF的血清培養液培養，并在第7天，收集細胞及上清，運用流式細胞技術檢測巨噬細胞表型表達，ELISA方法檢測細胞上清IL-10、 IL-12含量變化，檢測巨噬細胞吞噬外來性抗原及刺激淋巴細胞分化的能力。 結果：與健康對照組相比，哮喘患兒外周血巨噬細胞表面表達的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明顯降低，CD206、CD14及CD23明顯升高(P均<0.05)；患兒巨噬細胞分泌的IL-10明顯降低(P<0.05)，IL-12與對照組相比無顯著變化(P>0.05)；外周血巨噬細胞吞噬能力明顯降低(P<0.05)；將患兒巨噬細胞與T淋巴細胞共培養，IL-4含量明顯升高，IFN-γ含量明顯降低(P均<0.05)。 結論：相比于健康對照組，哮喘患兒外周血巨噬細胞呈現M2型，提示巨噬細胞與哮喘疾病具有很大的相關性。

巨噬細胞；哮喘；表型

哮喘是一種由多種因素導致的復雜性疾病，其致病機制至今未明，但多種研究認為其與免疫因素密切相關[1]。巨噬細胞作為機體內重要的固有免疫細胞，在機體起著重要作用。根據活化后功能的不同，巨噬細胞可分為M1及M2型巨噬細胞，不同的巨噬細胞可誘發不同的T細胞免疫應答。已經明確的是，哮喘患兒體內存在Th1/Th2亞群失衡，且Th2占優勢[2]，鑒于巨噬細胞在免疫系統中的重要作用，我們推測巨噬細胞在哮喘患兒的發病機制中起到了重要的作用。因此，本研究提取哮喘患兒的外周血，分離純化得到巨噬細胞，觀察巨噬細胞的表型和功能的變化，來探討巨噬細胞在哮喘疾病發生發展中的意義。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料(1)實驗組：選取2013年1月到2015年6月在我院兒科就診的哮喘患兒50例，其中男30例，女20例，年齡為2～6歲，平均(4.9±7.6)歲。患兒病情符合中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的哮喘診斷標準[3]，為急性發作者,此次發作前4周已停用糖皮質激素等免疫抑制劑，患兒均無嚴重心、肝疾病史，近期無呼吸道感染 ，排除患兒自身存在風濕性關節炎、系統性血管炎等其他風濕性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影響免疫系統的疾病，并排除入院3月來使用激素或免疫抑制劑及免疫調節藥物的患兒。(2)對照組：選取門診查體的健康患兒50例，其中男性28例，女性22例，年齡為2～7歲，平均(4.2±6.5)歲。對照組患兒不存在哮喘的臨床癥狀，無嚴重心、肝疾病史，近期無呼吸道感染，無糖皮質激素等免疫抑制劑使用史。實驗組與對照組在性別、年齡等方面差異不存在統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本實驗研究符合本單位的倫理學標準并得到批準，且已獲得患兒與監護人的知情同意。

1.1.2主要試劑人單核細胞分離液試劑盒購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，GM-CSF細胞因子購于Peprotech公司，流式抗體CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23及IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ酶聯免疫試劑盒均購于ebioscience公司，異硫氰酸酯(FITC)標記的右旋糖苷(dextran)購于Sigma公司。

1.1.3標本采集分別收集對照組及實驗組哮喘發作后立即抽取血液標本8 ml，肝素抗凝。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞的分離培養將血液標本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴格按照人單核細胞分離液試劑盒說明書步驟進行操作，將混合液輕輕置于分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時會出現分層，將第二層白膜細胞吸出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得單個核細胞備用。配置含有10%胎牛血清的1640培養基，并加入GM-CSF細胞因子，終濃度為10 ng/ml。將獲得的單個核細胞用上述聯合培養基重懸，于6孔板中培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。48 h后全量換液，棄去漂浮的細胞，并再加入上述聯合培養基繼續培養，隔天進行半量換液。繼續培養至第7天，細胞刮刀刮取收集細胞及上清用于實驗檢測。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞表型收集培養第7天的細胞，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標記的流式抗體CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細胞儀進行檢測，記錄結果為陽性細胞所占的比例。

1.2.3細胞因子檢測 收集培養第7天的細胞上清，嚴格按照試劑盒說明書，應用IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ 酶聯免疫試劑盒，檢測上清細胞因子含量。

1.2.4同種混合淋巴細胞反應取健康志愿者外周血10 ml，經過淋巴細胞分離液梯度離心后獲取單個核細胞，PBS洗滌后，于培養皿中培養，置于37℃、5%CO2培養箱中，24 h后收集懸浮細胞，視其為T淋巴細胞。將收集培養第7天的巨噬細胞用絲裂霉素C 25 μg/ml，處理 45 min后用PBS洗滌收集細胞，用10%胎牛血清的1640培養基重懸，調整細胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并將淋巴細胞也用10%胎牛血清的1640培養基重懸，調整細胞濃度為1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使巨噬細胞與淋巴細胞混合的最終容積為200 μl，然后置于37℃、5%CO2培養箱培養72 h。于培養結束時取細胞上清細胞因子分泌來檢測T淋巴細胞分化狀況。

1.2.5吞噬功能檢測收集培養第7天的細胞，應用PBS溶液調整細胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于流式管中，每管加入10 μl用異硫氰酸酯(FITC)標記的抗體右旋糖苷 ，斡旋混勻，4℃孵育50 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細胞儀進行檢測，記錄結果為陽性細胞所占的比例。

2　結果

2.1各組對象外周血巨噬細胞表面共刺激分子表達哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細胞表面表達的CD64、CD11c、CD40明顯低于對照組，CD206、CD14及CD23明顯高于對照組，各組差異均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表1。

2.2各組對象外周血巨噬細胞細胞因子分泌哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細胞分泌的IL-10明顯低于對照組存在統計學意義(P<0.05)，分泌的IL-12與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，具體見表2。

2.3各組對象外周血巨噬細胞吞噬能力哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細胞吞噬能力明顯低于對照組，均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表3。

表1　各組對象外周血巨噬細胞表面共刺激分子表達變化±s,n=50)Tab.1　Phenotype expression of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表2　各組對象外周血巨噬細胞細胞因子分泌變化±s,n=50)Tab.2　Cytokine secretion of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表3　各組對象外周血巨噬細胞吞噬能力±s,n=50)Tab.3　Phagocytic capacity of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表4　各組對象外周血巨噬細胞刺激T淋巴細胞分泌細胞因子±s,n=50)Tab.4　Cytokine secretion of T lymphocyte in each ±s,n=50)

2.4各組對象外周血巨噬細胞刺激T淋巴細胞分化哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細胞刺激T淋巴細胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組，各組差異均存在統計學意義(P<0.05)，具體見表4。

3　討論

支氣管哮喘是由多種細胞，如嗜酸粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞等浸潤為主的氣道慢性變態反應性炎癥,其中T淋巴細胞是最重要的致病性細胞。目前普遍認為，Th1/Th2細胞失衡，Th2占優勢與哮喘發病密切相關[4]。Th1細胞主要分泌IL-12、IFN-γ等，介導與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答，可提高巨噬細胞的吞噬能力[5]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等，介導抗體生成和寄生蟲免疫，參與體液免疫，在感染和環境變應原的應答中起重要作用[6]。有研究發現，CD4+T細胞僅在過敏原存在的情況下，并不能導致Th1/Th2細胞失衡，而在巨噬細胞共培養的情況下，Th2優勢明顯增加，T細胞分化即存在失衡，說明了巨噬細胞在哮喘發病中起著重要作用[7]。

巨噬細胞作為體內重要的固有免疫細胞，以往多認為巨噬細胞的主要作用為清除機體損傷、衰老或凋亡的細胞以及抗原性異物，如病原體和免疫復合物等。近年來，隨著巨噬細胞生物學特性和功能的深入研究，發現巨噬細胞的功能狀態可極大影響T淋巴細胞功能，會直接影響免疫應答的反應，從而影響機體的各種生命活動，因此巨噬細胞的重要性被重新評估和強調。已明確的是，巨噬細胞分為M1及M2型。 M1型巨噬細胞，主要由Th1細胞分泌的細胞因子或脂多糖等誘導生成，表現為抗原提呈功能增強，可分泌多種細胞因子，如IL-12、IL-6以及趨化因子，如CXCL-9、CCL-5等，高表達多種表面因子，如CD64、CD11c、CD40，參與Th1免疫應答，導致炎性損傷，可殺傷體內腫瘤和病原體[8,9]。M2型巨噬細胞，主要由Th2細胞分泌的細胞因子，如IL-4及IL-13等誘導生成，表現為高分泌多種細胞因子，如TNF-α、IL-1清道夫受體以及趨化因子CCL17 和 CCL24 等，高表達多種表面因子，如CD206、CD14及CD23，可促進Th2免疫應答，參與組織的損傷修復和纖維變性[10,11]。目前多數研究認為，在M1及M2型巨噬細胞之間還存在另一種細胞及調節性巨噬細胞，通過高表達IL-10來參與多種疾病的發生發展[11,12]。

本研究可以看出，與健康對照組相比，哮喘患兒外周血巨噬細胞表面表達的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明顯降低(P<0.05)，CD206、CD14及CD23明顯升高(P<0.05)；哮喘患兒巨噬細胞分泌的IL-12與對照組相比無顯著變化(P>0.05)。以上結果均提示哮喘患兒外周血巨噬細胞呈現M2型極化。并且，研究發現哮喘患兒外周血巨噬細胞吞噬能力明顯低于對照組，提示巨噬細胞在極化變化的情況下，成熟度也明顯下降。進一步研究發現，將患兒巨噬細胞與T淋巴細胞共培養，IL-4(Th2細胞因子)含量明顯升高，IFN-γ(Th1細胞因子)含量明顯降低，即驗證了，巨噬細胞可以顯著誘導T細胞向Th2極化，從而導致Th1/Th2失衡，誘導疾病生成。與此同時，研究發現哮喘患兒巨噬細胞分泌IL-10明顯下降，提示調節性巨噬細胞含量降低，這與多種研究結果基本吻合，其他研究表明哮喘患者肺巨噬細胞IL-10表達量明顯下降，并且下降量與疾病的嚴重程度正相關[13,14]。本研究也提示了哮喘患兒外周血調節性巨噬細胞含量較正常組明顯下降,與國內外多項研究吻合。

綜上所述，相對于健康對照者，哮喘患兒外周血巨噬細胞呈現M2型分化，由此可見巨噬細胞參與了哮喘疾病的發生與發展，并在其中起著重要作用。

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[收稿2015-11-02修回2016-03-10]

(編輯張曉舟)

Study on polarization of macrophage in peripheral blood of patients with asthma

CHEN-Na,PANG Bao-Dong.Department of Pediatiric Internal Medicine,Tangshan Maternity and Child Health Hospital,Tangshan 063000,China

Objective:To investigate the different function of macrophage between patients with asthma and healthy control, and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with asthma, and isolation of blood macrophage. Then samples were induced with GM-CSF, and cells were collected on day 7. Macrophage function was evaluated using the following methods: fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers and phagocytosis;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production and the induction of T cell.Results: Compared with the control group, asthma group had decreased CD64, CD11c, CD40 expression, and increased CD206, CD14, CD23 expression(P<0.05);displayed the decreased IL-10 level(P<0.05);displayed a decreased phagocytosis ability(P<0.05);when co-cultured with T cells, the supernatantdisplayed the increased IL-4 expression, and decreased IFN-γ level(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group, macrophage in asthma group displayed M2 phenotype, which inditates macrophage play the important role in the pathogenesis of asthma.

Macrophage;Asthma;Polarization

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.028

R256.12文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1208-04

陳娜(1979年-)，女，副主任醫師，主要從事兒科方面的研究。