miRNA-15a在前列腺癌中的表達及診斷意義

姚春紅　袁新初　劉　沖　鄧建平

(武漢科技大學醫學院， 武漢430081)

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miRNA-15a在前列腺癌中的表達及診斷意義

姚春紅袁新初劉沖①鄧建平①

(武漢科技大學醫學院， 武漢430081)

①湖北省黃石市愛康醫院，黃石435000。

目的：檢測前列腺癌患者miRNA-15a的表達情況，探討其在前列腺癌診斷的意義。方法：選擇2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者血清及腫瘤組織36例，良性前列腺增生患者(Prostatic hyperplasia，BPH)血清40例，健康對照血清40例。miRNA-15a表達采用實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)技術檢測。結果：miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對照血清的表達量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)，miRNA-15a在前列腺癌患者血清中的表達量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對照(P<0.05)，在BPH組和對照組中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，前列腺癌患者血清miRNA-15a表達在不同PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期、有無遠處轉移之間差異有統計學意義(P<0.05)，與其他病理因素無關(P>0.05)；前列腺癌患者腫瘤組織中的miRNA-15a的表達與PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期、有無遠處轉移之間差異有統計學意義(P<0.05)，與其他病理因素無關(P>0.05)。結論：miRNA-15a低表達參與了前列腺癌的發生、發展過程，是前列腺癌輔助診斷及治療的潛在的指標。

前列腺癌；良性前列腺增生；miRNA-15a

前列腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤，是男性因癌癥死亡的第二大原因，發病率隨年齡增長而升高[1,2]。前列腺癌早期通常沒有癥狀，只有當腫瘤阻塞尿道、膀胱頸時，發生類似下尿道梗阻或刺激癥狀，才引起注意。因此早期診斷和早期治療是決定腫瘤患者治愈率及預后的一個重要因素，尋找可靠、有效的分子標記物來指導前列腺癌的診斷和預后分析仍然是臨床上研究的熱點[3]。微小RNA(miRNA)是一種大小為22 nt左右的非編碼單鏈小分子。其通過與靶基因互補配對，在翻譯水平調控基因的表達，在細胞的增殖和凋亡、器官形成、發育等生命過程中發揮著重要的作用[4]。miRNA-15a定位于人類染色體13q14.2，屬于miRNA-15家族，研究表明miR-15a在腫瘤中表達缺失或下調。本研究檢測了前列腺癌患者miRNA-15a表達的情況，探討其與前列腺癌的關系，研究其對前列腺癌診斷的價值，并分析miRNA-15a的表達水平與PCa臨床病理參數的關系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選擇2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者36例，年齡49～73歲，平均(63.44±6.41)歲，其中患者年齡≥60歲24例，<60歲12例；腫瘤按TMM(2012AJCC)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；病理按Gleason評分分級：高分化腺癌(Gleason 2～6分)24例，中分化腺癌(Gleason 7分)7例，低分化腺癌(Gleason 8～10分)5例。BPH患者30例，平均年齡(61.6±8.1)歲，對照者為40例健康體檢男性血清，年齡22～55歲，平均(35.7±18.34)歲。所有標本-80℃保存。所有疾病術前未做任何治療、放療和化療。

1.1.2主要試劑和儀器Trizol、RNA提取試劑盒、M- MLV逆轉錄酶、熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測試劑盒購自大連寶生物科技公司，Has-miRNA-15a莖環引物由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成，Real-time PCR儀為美國羅氏公司產品。

1.2方法

1.2.1標本收集與處理采集患者靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，吸取上清于2 ml離心管中，再次12 000 r/min離心2 min，吸取上層無細胞血清200 μl，置于-80℃ 低溫冰箱內保存待測。采用Trizol試劑從血清樣本中提取總RNA，紫外分光光度計測RNA濃度及純度，取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續試驗。蠟塊組織標本RNA抽提按照 Trizol 說明書進行。取200 ng總RNA，M- MLV逆轉錄酶進行逆轉錄，反應體系為20 μl，包括10×緩沖液2 μl，M-MLV(10 U/μl)0.4 μl，引物(400 nmol/L)0.5 μl，RNA 酶抑制劑(40 U/μl)0.6 μl，dNTP混合物(2.5 mol/L)2 μl，補超純水至20 μl。 反應條件為 16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min滅活逆轉錄酶，產物置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2SYBRGreen法檢測miRNA-15a表達水平加入1 mlTrizol，按照試劑盒說明提取細胞RNA，逆轉錄莖環引物和M- MLV逆轉錄酶反轉錄，TaqDNA聚合酶、Has-miRNA-15a莖環引物和SYBRGreen熒光染料定量檢測miRNA-15a的表達量。Has-miRNA-15a莖環引物序列為：上游序列5′-GCTGTGGAGAGAAAGGCAGTCTG-3′；下游序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。其中以U6作為內參引物，其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相對表達量計算公式為RQ=2-△△CT。

2　結果

2.1前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常對照的血清miR-15a表達水平 miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對照血清的表達量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表達量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對照的血清miR-15a表達水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康對照的血清miR-15a表達水平無顯著性差異(P>0.05)。如圖1。

2.2前列腺癌患者血清miRNA-15a表達變化與PCa 臨床病理參數的相關性將前列腺癌患者年齡、PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期、有無遠處轉移進行分組，結果顯示積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的表達量分別為(0.256±0.06)和(0.162±0.071)，差異有統計學意義(P<0.05)。血清miRNA-15a表達水平與臨床分期相關(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的表達水平降低。骨轉移的前列腺癌miRNA-15a表達量與未轉移者相比，差異有統計學意義(P<0.05)。但miRNA-15a表達量與PSA水平無關(均P>0.05)，見表1。

2.3前列腺癌患者腫瘤組織中miRNA-15a表達變化與PCa 臨床病理參數的相關性將前列腺癌患者年齡、腫瘤大小、PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期、有無遠處轉移等進行分組，結果顯示腫瘤患者PSA 表達量<10與≥10的患者腫瘤組織中的表達量分別為(0.440±0.178)和(0.304±0.185)，差異有統計學意義(P<0.05)；積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的患者腫瘤組織中的表達量分別為(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差異有統計學意義(P<0.05)。血清miRNA-15a表達水平與臨床分期相關(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的表達水平降低。骨轉移的前列腺癌miRNA-15a表達量與未轉移者相比，差異有統計學意義(P<0.05)。但miRNA-15a表達量與其他病理參數無關(均P>0.05)，見表2。

圖1　前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常對照的血清miR-15a表達水平Fig.1　Benign prostatic hyperplasia,prostate cancer patients and normal controls expression level of serum miR-15aNote: MiRNA-15a amount of expression in prostate cancer patients was significantly lower than patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls(P<0.05),patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls there was no significant difference(P>0.05).

表1　前列腺癌患者血清miRNA-15a表達水平與臨床參數的相關性Tab.1　Correlation between expression of serum miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

表2　前列腺癌患者腫塊miRNA-15a表達水平與臨床參數的相關性Tab.2　Correlation between expression of tumor miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

3　討論

前列腺癌發病機制尚不明確[5,6]，前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺癌篩選、診斷及預后判斷的常用血清學指標，雖然PSA診斷PCa的標準臨界值為4.0 ng/ml，但其陽性預測率僅為41.5%[7]，因此PSA的臨床運用存在一定的局限性，如良性前列腺增生及前列腺炎等均會出現不同程度的PSA升高，以致影響臨床醫生的診斷。研究表明miRNA參與前列腺癌的發生、發展密切相關[8-10]，miRNA控制著機體60%以上的基因調控網絡。miRNA-15a在多種人類癌癥細胞中過表達，具有負調控作用[11]，能夠在轉錄后水平抑制BCL2、CCDI和WNTBA的表達，從而干擾癌基因的多種活動，起到抑制腫瘤發生、發展的作用。最近研究發現，VEGF等也參與miRNA-15a在前列腺癌發生、發展中的抑制作用，這種抑制作用是不依賴于轉錄作用的，通過多途徑對前列腺癌的發展起抑制作用[12]。本研究采用莖環逆轉錄-熒光定量的方法檢測了36例前列腺癌組織中miRNA-15a的表達，與良性前列腺增生患者和健康對照比較，發現miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對照血清的表達量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表達量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對照的血清miR-15a表達水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康對照的血清miR-15a表達水平無顯著性差異(P>0.05)。腫瘤組織miRNA-15a表達水平與臨床分期相關(P<0.05)，并且與Gleason積分、臨床分期及骨轉移有關(P<0.05)，但與是否復發及血清PSA水平無明顯相關性(P>0.05)。本研究顯示積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的患者腫瘤組織中的表達量分別為(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差異有統計學意義(P<0.05)。miRNA-15a表達水平與臨床分期相關(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的

表達水平降低。miRNA-15a在PCa中明顯低表達，因此通過檢測miRNA-15a的表達水平能夠將PCa患者與健康對照者區分開來，在很大程度上可能會提高臨床上對PCa患者的早期診斷率。本研究觀察到miRNA-15a表達在高PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期和有遠處轉移的前列腺癌患者顯著低于低PSA表達水平、Gleason評分、臨床分期和無遠處轉移的前列腺癌患者。Gleason評分代表著腫瘤分化的程度，Gleason評分≥7分多屬中高危，Gleason評分≤7分者多系低危，可以推斷miRNA-15a低表達可能與前列腺癌的發生、發展及侵襲轉移，并可能成為前列腺癌預后評估的監測因子。

綜上所述，從前列腺癌的早期診斷來看，需要發現靈敏度和特異度較高的診斷標志物，提高診斷率，以減少前列腺穿刺帶來的風險和不便。本研究顯示前列腺組織中miR-15a的表達與前列腺癌的組織學分級、臨床分期和轉移等密切相關，低表達參與了前列腺癌的發生、發展過程，miRNA-15a可作為前列腺癌非侵入性診斷和預后的分子標志。

[1]Heidenreich A,Bastian PJ,Bell munt J,etal.Guidelines on Prostate Cancer[J].Euro Association Urol,2014,65(1):124-137.

[2]Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[3]許華,李勝水,李雙標,等.良惡性前列腺組織中S100P與AR的表達及臨床意義[J].現代泌尿外科雜志,2013,18(3):271-274.

[4]劉曉軍,姚旭東,葉定偉.長鏈非編碼RNA在前列腺癌中的研究進展[J].腫瘤,2014,34(2):187-190.

[5]Veltri RW,Christudass CS.Nuclearmorphometry,epigenetic cha-nges,and clinical relevance in prostate cancer[J].Adv Exp Med Biol,2014,773(1):77-99.

[6]伍信陽,畢學成,何慧嬋,等.SOX9基因在前列腺癌與前列腺增生中的表達以及意義[J].中國現代醫學雜志,2013,23(9):47-49.

[7]Moyer VA.U.S.Preventive Services Task Force.Screening for prostate cancer：U.S.Preventive Services Task Force recommendation statement[J].AnnI Intern Med,2012,157(2):120-134.

[8]DeVer White RW,Vinall RL,Tepper CG,etal.MicroRNAs and their potential for translation in prostate cancer[J].Urol Oncol,2009,27(3):307-311.

[9]Leite KR,Sousa-Canavez JM,Reis ST,etal.Change in expression of miR-let7c,miR-100,and miR-218 from high grade localized prostate cancer to metastasis[J].Urol Oncol,2011,29(3):265-269.

[10]Suh SO,Chen Y,Zaman MS,etal.MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer[J].Carcinogenesis,2011,32(5):772-778.

[11]李艷杰,李德鵬,閏志凌,等.miRNA和Thl7相關細胞因子在多發性骨髓瘤患者中的表達及其意義[J].中華血液學雜志,2015,2(2):125-130.

[12]Qu F,Cui X,Hong Y,etal.MicroRNA-15a suppresses proliferation,invasion, migration,and tumorigenicity of human prostate cancer cells through targeting and rogen receptor[J].Mol Cell Biochem,2013,377(1/2):121-130.

[收稿2015-11-13修回2016-03-09]

(編輯許四平)

Expression and diagnostic value of miRNA-15a in prostate cancer

YAO Chun-Hong,YUAN Xin-Chu,LIU Chong,DENG Jian-Ping.Wuhan University of Science and Technology School of medicine Wuhan 430081,China

Objective:To explore the diagnostic value of miRNA-15a in patients with prostate cancer.Methods: From January 2014 to January 2015,Gene expression of MiRNA-15a were examined in 36 serum and tumor tissue samples from prostate cancer,40 benign prostatic hyperplasia(BPH)and 40 health volunteers,which examined by quantitative Real-time reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results: The serum expression of miRNA-15a were (0.193±0.081),(0.359±0.04) and (0.376±0.037) in patients with prostate cancer,benign prostatic hyperplasia and healthy controls respectively.miRNA-15a expression was significantly lower in BPH and healthy controls than patients with prostate cancer(P<0.05).There were no significant difference between BPH and control group(P>0.05).Serum miRNA-15a expression in patients with prostate cancer at different expression levels PSA,Gleason score,clinical stage,the difference between the presence of distant metastasis was statistically significant(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05);Prostate cancer tumor tissue expression and PSA expression levels of miRNA-15a,Gleason score,clinical stage,presence of distant metastasis was statistically significant difference between(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05).Conclusion: Low expression of miRNA-15a may be contributed in the development of prostate cancer,and the expression levels miRNA-15a may be considered potential novel biomarkers for the diagnosis of prostate cancer.

Prostate cancer;Benign prostatic hyperplasia;miRNA-15a

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.030

R737文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1219-04

姚春紅(1972年-)，男，副主任技師，主要從事免疫學檢驗，E-mail:ych335@163.com。

及指導教師：袁新初(1953年-)，男，教授，主要從事心血管疾病和腫瘤的研究，E-mail:y5307@126.com。