動物性食品中頭孢氨芐殘留檢測研究進展

張 偉，王 興，劉金萍，秦海艷，劉若璇，蔡云虹，汝曉飛，王捍東

(揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009)

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動物性食品中頭孢氨芐殘留檢測研究進展

張 偉，王 興，劉金萍，秦海艷，劉若璇，蔡云虹，汝曉飛，王捍東*

(揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009)

頭孢氨芐屬于人獸共用β-內酰胺類抗生素，在獸醫臨床上應用廣泛。介紹了頭孢氨芐的性質、危害及國內外主要的檢測方法和技術，包括紫外分光光度法、高效液相色譜法、液質聯用、毛細管電泳法、酶聯免疫吸附法、熒光偏振免疫法、免疫層析法，并對頭孢氨芐殘留分析前景進行了展望。

頭孢氨芐；抗生素殘留；危害；檢測方法

頭孢氨芐(Cephalexin，CEX)，又稱頭孢菌素Ⅳ、先鋒霉素Ⅳ、頭孢立新等，屬于第一代人工半合成頭孢菌素類抗生素，其作用機制主要是在細菌的分裂繁殖期通過抑制細菌細胞壁的合成，使細菌在外部滲透壓的作用下死亡。相對于其他幾種獸用頭孢類抗生素，頭孢氨芐有著價格低廉、可口服吸收等優點，因此在獸醫臨床中應用較為廣泛，常用于治療動物尿道感染、皮膚感染、奶牛的乳腺炎等。我國農業部第235號文件規定，頭孢氨芐在牛體內最大殘留限量(MRLs)分別為：奶100 μg/kg、肌肉200 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝200 μg/kg、腎1 000 μg/kg[1]。但隨著動物疫病的不斷增加與復雜化，以及不遵守停藥期規定等，使頭孢氨芐在動物性食品中的殘留情況日趨嚴峻，尤其以牛奶中的過量殘留最為嚴重，已成為危及人類健康的食品安全問題，并嚴重影響到貿易出口。有研究顯示，頭孢菌素類抗生素在畜禽養殖場中超標使用現象普遍，其中頭孢氨芐占較大比例[2]。因此，針對頭孢氨芐殘留，建立一種快速、準確、簡便的檢測方法十分重要，筆者對頭孢氨芐的危害及檢查方法進行了綜述。

1　頭孢氨芐的性質與危害

1.1頭孢氨芐的理化性質頭孢氨芐的化學名稱為(6R，7R)-3-甲基-7-[(R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，傳統合成方法是以7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(7-Amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid，7-ADCA)為母核并與苯甘氨酸甲酯(D-phenylglycine methyl ester，PGM)經過酯化氧化、重排、酰化、水解等步驟合成得到[3]。分子式為C16H17N3O4S，摩爾分子量為347.39 g/mol，熔點為326.81 ℃，沸點為636.05 ℃。頭孢氨芐的化學結構見圖1。

圖1　頭孢氨芐化學結構Fig. 1　Chemical structure of Cephalexin

常溫下頭孢氨芐呈白色或微黃色結晶性粉末，微臭，在水中微溶，在乙醇、三氯甲烷或乙醚中不溶。加水溶解并定量稀釋成每1 mL中含5 mg的溶液，其比旋度為+149°～+158°，在262 nm紫外吸收區有最大吸收波長[4]。頭孢氨芐在干燥狀態下較穩定，對紫外光敏感，由于含有內酰胺環，在堿性條件下易水解開環。

1.2頭孢氨芐的危害頭孢氨芐屬于人獸共用的廣譜抗生素，其殘留問題比動物專用抗生素更為嚴重。一方面，長期攝入廣譜抗生素殘留的動物產品，會使人體內敏感菌群受到抑制，導致人體內菌群比例失調，消化道功能紊亂，免疫力下降，影響人類健康。另一方面，人類的病原菌長期接觸頭孢氨芐，就有可能誘導產生耐藥性菌株，對病人的診斷、治療造成惡劣影響，而且病原菌的耐藥基因可以在人群中、動物群中、生態系統中的細菌間相互傳遞，由此可引發更為嚴重的耐藥性問題。

在傳統的頭孢氨芐生產工藝過程中，會使用大量化學試劑，而其中部分化學試劑由于較難分離而發生殘留，如N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)、2-萘酚(2-Naphthol)等。研究已證實，DMF具有肝毒性[5-6]、腎毒性[7]、心臟毒性[8]等，并有致癌、致畸、致突變的可能[6，9]；2-萘酚對皮膚、黏膜有強烈的刺激作用[10]，對機體的免疫系統有一定的抑制作用[11]，可在短時間內迅速穿過胎盤屏障，并有致癌的風險[12]。

在水環境中，頭孢氨芐易發生水解，其水解產物7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)有較強的生長抑制毒性，因此頭孢氨芐具有一定的生態毒性。

2　頭孢氨芐殘留檢測的概況

目前，國內外用于檢測頭孢氨芐的方法主要包括理化檢測方法和免疫學檢測方法兩大類。

2.1理化檢測方法依據頭孢氨芐的物理和化學性質，如分子量大小、溶解性、熔沸點、分子基團特點、共軛形式等，對其進行定性和定量分析的方法。主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法、液質聯用、毛細管電泳法等方法。

2.1.1紫外-可見分光光度法(UV-Vis)。紫外-可見分光光度法是通過測定待測物質在紫外光區和可見光區范圍內光的吸光度或發光強度，對該物質進行定性、定量、結構分析的方法。G.Venkata Prasad等依據頭孢氨芐在紫外光區下有特殊的發光基團且在一定濃度范圍內其吸光度與濃度成正比，通過繪制標準曲線求出樣品中頭孢氨芐的含量，試驗結果顯示，在磷酸鹽緩沖液(pH 2.0)中，頭孢氨芐的定量范圍為5～40 μg/mL，其定量限(LOQ)和檢測限(LOD)分別為2.85、0.855 μg/mL[13]。王學立等亦采用紫外分光光度法對原料奶中頭孢氨芐的含量進行測定，試驗結果表明，紫外分光光度法操作簡單，所需時間短、重現性好，平均回收率99.88%，最小檢出限為0.50 μg/mL[14]。

2.1.2高效液相色譜法(HPLC)。高效液相色譜法具有選擇性高、靈敏度高、重現性良好等優點，是國際上檢測頭孢氨芐殘留的主要方法之一。蔡玉娥等用高效液相色譜法檢測牛奶和尿液當中多種頭孢類抗生素，組織樣品加20%乙酸后再加入水，冷凍離心取上清，之后過濾稀釋，進樣檢測[15]。固定相：C16色譜柱(46 mm×150 mm，5 μm)；進樣：20 μL；流動相A：水∶磷酸緩沖液(98∶2，V/V)；流動相B：乙腈∶水∶磷酸緩沖液(10∶9∶1，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外/可見光(UV/VIS)檢測器；檢測波長：270 nm；其中頭孢氨芐檢測限達5.60 μg/L，回收率高。Regina V.Oliveira等使用柱切換高效液相色譜法測定牛奶和脫脂奶中的頭孢氨芐[16]，以C8-牛血清白蛋白(bovine serum albumin)RAM柱(100 mm×4.6 mm，10 μm)作為第一柱去除牛奶樣品中的蛋白質，以C18分析柱為第二柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；進樣：20 μL；流動相：磷酸鹽緩沖液(pH 7.5，0.01 mol/L)∶丙烯晴(98∶2，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外/可見光(UV/VIS)檢測器；檢測波長：260 nm。在以上條件下檢測樣品中頭孢氨芐，結果表明，頭孢氨芐在25～1600 ng/mL濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好線性關系，方法的定量限(LOQ)為20 ng/mL、檢測限(LOD)為10 ng/mL，且平均回收率高。

2.1.3液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)。液相色譜-質譜聯用法是將分離能力高的液相色譜與高靈敏的質譜技術充分結合的一種分析工具，具有分辨率高、樣品損失少、自動化程度高等優點。倪梅林等采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化樣品[17]，經MG-Ⅱ C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)色譜柱分離，在LC-MS/MS多反應監測(MRM)模式下對動物組織和水產品中頭孢氨芐定性定量分析，結果表明，頭孢氨芐定量限為0.01 mg/kg，相對標準偏差RSD為5.30%～12.10%，方法回收率為75%～106%。顧蓓喬等建立一種超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀(UPLC-MS/MS)檢測水產品中頭孢菌素類藥物殘留的方法[18]，樣品經過提取、凈化、濃縮、過濾等一系列處理后，采用外標法測出頭孢氨芐等抗生素殘留量，研究表明，頭孢氨芐在2～100 μg/L質量濃度范圍內，線性關系良好，定量檢出限為2.00 μg/kg，平均回收率為76.70%～93.10%，相對標準偏差RSD<13%。

2.1.4毛細管電泳法(CE)。毛細管電泳兼具電泳和色譜的特點，樣品在電場力的作用下，在裝有電泳介質的毛細管中遷移，根據帶電粒子的遷移速度不同而進行分離，具有高效、快速、微量、多模式、自動化程度高等優點。張小莉等建立了一種快速檢測頭孢氨芐的毛細管電泳法[19]，試驗以枸櫞酸昔多芬為內標，分離電壓14 kV，檢測波長214 nm，每次進樣前用25 mmol/L硼砂緩沖液沖洗3 min，結果顯示，頭孢氨芐在33.90～678.00 μg/mL濃度范圍呈良好的線性關系，相關系數為0.999 6，回收率在97.90%～102.40%。然而許多動物組織樣品成分和基質復雜，所以對肉、蛋、奶等樣品中的相關藥物測定時，通常需要對樣品進行一系列的前處理過程。汪雪雁等采用分子印跡固相萃取技術(MISPE)作為樣品前處理方法，克服了樣品體系復雜、預處理繁瑣等困難，成功建立了分子印跡固相萃取-毛細管電泳(MISPE-HPCE)檢測雞肉中頭孢菌素藥物的分析方法[20]，結果表明，頭孢氨芐在3.125～100.000 μg/mL時線性關系良好，相關系數為0.998 5，定量限(LOQ)和檢出限(LOD)分別為80 μg/kg和50 μg/kg，樣品回收率為78.00%～83.04%，RSD為2.18%～3.79%。

2.2免疫學檢測方法免疫學檢測方法是以抗原和抗體的特異性結合為基礎，利用膠體金、熒光素、酶及化學發光劑等作為追蹤物，并借助電子顯微鏡、光學顯微鏡、酶標檢測儀等儀器定性或定量檢測出樣品中物質含量的方法，主要包括酶聯免疫吸附測定、熒光偏振免疫、免疫層析法等。

2.2.1酶聯免疫吸附測定(ELISA)。酶聯免疫吸附法是采用酶標記抗體(或抗原)，使其與相應的抗原(或抗體)特異性結合，然后通過酶與底物的顏色反應，進行定性定量的檢測方法。常用標記酶有：辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶(GOD)等。Chen Liben等通過碳二亞胺法合成免疫原免疫小鼠，并結合雜交瘤技術篩選出針對頭孢氨芐的雜交瘤細胞株，建立一種快速檢測頭孢氨芐的ELISA方法，檢測范圍為1～50 μg/kg，檢測限為0.39 μg/kg[21]。卞素敏等采用戊二醛法將頭孢氨芐偶聯于雞卵清白蛋白(OVA)并作為檢測抗原，利用頭孢氨芐單克隆抗體建立了牛奶中頭孢氨芐殘留的間接競爭酶聯免疫吸附(CiELISA)檢測方法，結果顯示，頭孢氨芐在1.0～50.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，檢測限為1.0 ng/mL[22]。

2.2.2熒光偏振免疫(FPIA)。熒光偏振免疫是利用熒光分子或熒光團經偏振光照射而被激發，在回復基態后可釋出光子，經偏振儀形成偏振熒光，再結合光學系統測定偏振熒光的強度。該熒光強度與熒光分子的大小呈正比，通過繪制標準曲線即可測定物質的含量。Zhang Jing等將頭孢氨芐單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)結合，成功建立一種在牛奶中快速檢測頭孢氨芐與頭孢羥氨芐的熒光偏振免疫檢測法，試驗證明，熒光偏振免疫檢測法在檢測頭孢氨芐殘留方面具有靈敏度高、精確度好、耗時短等優點，頭孢氨芐檢出限為1.80 ng/mL，回收率介于82%～125%，變異系數(CV)在3.20%～14.20%[23]。

2.2.3免疫層析法(IC)。免疫層析法是利用抗原和抗體特異性結合的一種親和層析法。胡佳麗等研制出一種用頭孢氨芐單克隆抗體制備的熒光免疫層析試紙條，示蹤標記物采用稀土銪熒光納米顆粒，以碳二亞胺法制備的頭孢氨芐-卵清蛋白(CEX-OVA)及羊抗鼠IgG作為檢測線和質控線，成功制備免疫層析試紙條，檢測快速，檢測限為0.16 ng/mL，并與ELISA方法進行對比，獲得了滿意的效果[24]。Guo Jingnan等則以膠體金作為標記物，檢測線上結合頭孢氨芐-血藍蛋白(CEX-KLH)，質控線上結合羊抗鼠IgG，所建立的檢測方法檢測時間不到5 min，用肉眼即可判定顯示結果，檢測限為(1.3±0.1)ng/mL[25]。

3　研究展望

頭孢氨芐作為人獸共用抗生素，與獸用抗生素相比可能存在更大的食品安全隱患，近年來研究發現，頭孢氨芐在空氣、土壤、水中均有檢出[26-28]，在動植物體內針對頭孢氨芐的抗性細菌也具有較高比例[28]，因此為保護人類及動物健康并提高我國動物性食品在國際貿易上的競爭力，除了完善相應的法律法規，建立和改進頭孢氨芐殘留檢測方法也顯得尤為重要。

目前，針對頭孢氨芐的檢測方法多以HPLC和LC-MS為主，其優點是準確度高、假陽性率低，適用于頭孢氨芐檢測方法的標準化，但這些方法需要的儀器價格昂貴、操作復雜、耗時長，難以滿足實際檢測中快速鑒定診斷的需要。近些年來，免疫學檢測技術被發展用于殘留檢測，因其具有靈敏度高、特異性強、分析容量大、操作簡單、檢測成本低等優點，深受人們的青睞，但免疫分析法也有自身的局限性，試驗的準確性和重復性都不及理化分析方法，出現假陽性和假陰性的概率也較大，而且所制備抗體的親和力與靈敏度也會對檢測結果產生影響。因此，如何制備高特異性的單克隆抗體及提高免疫分析法的靈敏度，避免假陽、陰性的出現還需要進一步研究。隨著科學技術的迅速發展，一些新的檢測技術也層出不窮，如免疫親和柱聯合高效液相色譜法、免疫磁珠法、蛋白芯片技術等，但這些方法成本較高，材料大多依靠進口，限制了其發展。因而在以后相當長的時間內，基層實際檢測中以HPLC和LC-MS為主的理化分析法仍占主要地位。

綜上所述，在實際檢測過程中，應該根據實際情況，選擇合適的檢測方法。目前來看，將免疫學方法與HPLC、LC-MS等理化分析方法結合起來是一種可行、易行的方案，以免疫學方法作為初篩法，以HPLC和LC-MS等方法作為定量法，不僅可以大規模快速篩選，而且也能保證檢測結果的可靠性，對保障食品安全及提高我國進出口貿易的國際競爭力都具有重要意義。

[1] 農業部.動物性食品中獸藥最高殘留限量(農業部公告[2002]235號)[A].北京:農業部，2002-12-24.

[2] QI S，Y，REN S W，LI X L ，et al.Multidrug-resistant bacteria in livestock feces[J].Acta ecologica sinica，2013，33(13):3970-3977.

[3] SCHREIBER F G.Process for preparing cephalexin monohydrate:U S，5142043[P].1992-08-25.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中藥醫藥科技出版社，2010.

[5] HAMADA M，ABE M，TOKUMOTO Y，et al.Occupational liver injury due to N，N-dimethylformamide in the synthetics industry[J].Internal medicine，2009，48(18):1647-1650.

[6] SENOH H，AISO S，ARITO H，et al.Carcinogenicity and chronic toxicity after inhalation exposure of rats and mice to N，N-dimethylformamide[J].Journal of occupational health，2004，46(6):429-439.

[7] 菅向東，闞寶甜，張秀蓮.二甲基甲酰胺對大鼠腎臟線粒體和微粒體45Ca 轉運的影響[J].中華勞動衛生職業病雜志，2001，19(1):62-64.

[8] DING R，CHEN D J，YANG Y J Liver and heart toxicity due to 90-day oral exposure of ICR mice to N，N-dimethylformamide[J].Environmental toxicology and pharmacology，2011，31(3):357-363.

[9] SHIEH D B，CHEN C C，SHIH T S，et al.Mitochondrial DNA alterations in blood of the humans exposed to N，N-dimethylformamide[J].Chemico-biological interactions，2007，165(3):211-219.

[10] 劉文生，張鳳林.淺議2-萘酚對人體的危害[J].中國社區醫師，2008，10(6):9.

[11] SUN H，SHEN O X，XU X L，et al.Carbaryl，1-naphthol and 2-naphthol inhibit the beta-1 thyroid hormone receptor-mediated transcriptioninvitro[J].Toxicology，2008，249(2):238-242.

[12] MIRGHANI H，OSMAN N，DHANASEKARAN S，et al.Transplacental transfer of 2-naphthol in human placenta[J].Toxicology reports，2015，2:957-960.

[13] PRASAD G V，SRAVANI S，ISHAQ B M，et al.Development and validation of UV-spectrophotometric method for determination of cephalexin[J].Asian journal of research in chemistry，2013，6(5):490-494.

[14] 王學立，程亮亮，溫俊柳，等.頭孢氨芐的紫外分光光度法測定[J].中國奶牛，2011(18):59-61.

[15] 蔡玉娥，蔡亞岐，牟世芬，等.高效液相色譜-紫外光度法檢測尿液和牛奶中多種頭孢類抗生素[J].分析化學，2006，34(6):745-748.

[16] OLIVEIRA R V，DE PIETRO A C，CASS Q B.Quantification of cephalexin as residue levels in bovine milk by high-performance liquid chromatography with on-line sample cleanup[J].Talanta，2007，71(3):1233-1238.

[17] 倪梅林，崔曉美，殷居易，等.動物組織與水產品中頭孢氨芐殘留量的液相色譜-串聯質譜檢測[J].分析測試學報，2009，28(4):489-492.

[18] 顧蓓喬，梅光明，喻亮，等.液相色譜-質譜聯用法測定水產品中頭孢菌素類殘留量[J].浙江海洋學院學報(自然科學版)，2015，34(3):222-226.

[19] 張小莉，張彥.毛細管區帶電泳法測定頭孢氨芐膠囊的含量[J].解放軍藥學學報，2006，22(2):144-146.

[20] 汪雪雁，祁克宗，陳玎玎，等.雞肉中頭孢類抗生素的MISPE-HPCE檢測[J].江蘇農業學報，2012，28(1):193-197.

[21] CHEN L，WANG Z，FERRERI M，et al.Cephalexin residue detection in milk and beef by ELISA and colloidal gold based one-step strip assay[J].Journal of agricultural and food chemistry，2009，57(11):4674-4679.

[22] 卞素敏，扈洪波，邢仕歌，等.ELISA 法檢測牛奶中頭孢氨芐殘留[J].食品科學，2013，34(20):186-189.

[23] ZHANG J，WANG Z，MI T，et al.A homogeneous fluorescence polarization immunoassay for the determination of cephalexin and cefadroxil in milk[J].Food analytical methods，2014，7(4):879-886.

[24] 胡佳麗，劉小雷，于東升，等.頭孢氨芐殘留熒光免疫層析試紙條的研制[J].中國藥學雜志，2014，49(12):1067-1072.

[25] GUO J，LIU L，XUE F，et al.Development of a monoclonal antibody-based immunochromatographic strip for cephalexin[J].Food and agricultural immunology，2015，26(2):282-292.

[26] 朱婷婷，宋戰鋒，段標標，等.深圳石巖水庫抗生素污染特征與健康風險初步評價[J].環境與健康雜志，2013，30(11):1003-1006.

[27] 張玉玲.化工區高致敏原料藥生產過程環境污染的風險評估[D]：濟南：山東大學，2013.

[28] 祁詩月，任四偉，李雪玲，等.禽畜養殖糞便中多重抗生素抗性細菌研究[J].生態學報，2013，33(13):3970-3977.

Recent Advances in the Determination of Cephalexin Residue in Animal Derived Foods

ZHANG Wei，WANG Xing，LIU Jin-ping，WANG Han-dong*et al

(College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009)

As a β-lactam antibiotic，Cephalexin can be used in both humans and animals.It has been widely applied in veterinary clinic.Firstly，the characteristics，hazard，the major detecting methods and technologies of Cephalexin in domestic and foreign were introduced.Methods and technologies，including Ultraviolet-Visible spectroscopy，High Performance Liquid Chromatography (HPLC)，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)，Capillary Electrophoresis (CE)，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)，Fluorescence Polarization Immunoassay (FPIA)，Immunochromatography (IC)，were described.Finally，prospects of analysis of Cephalexin residue were presented.

Cephalexin; Antibiotic residues; Hazard; Detection methods

張偉(1991- )，男，安徽淮南人，碩士研究生，研究方向：動物性食品安全衛生。*通訊作者，教授，碩士生導師，從事動物性食品安全衛生方面的研究。

2016-05-23

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)19-084-03