深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在畢赤氏酵母SMD1168中表達的研究

王長遠，全　越，沈冰蕾，姚　笛，于長青

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶　163319）

?

試驗研究

深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在畢赤氏酵母SMD1168中表達的研究

王長遠，全越，沈冰蕾，姚笛，于長青

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

引物根據Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）基因以及酵母蛋白表達載體pGAPZαA的多克隆位點進行引物設計，并在上游插入ECoRⅠ位點、下游插入XhoⅠ位點，從深黃被孢霉中克隆D6D基因，構建pMD18-T-D6D載體與pGAPZαA-D6D載體。將重組質粒線性化，并將其電轉導入到畢赤氏酵母（Pichia pastoris SMD1168）中，Zeocin抗生素篩選高拷貝轉化子，對重組菌進行誘導表達。經過Tricine-SDS-PAGE分析和蛋白質免疫印跡（Western bloting）試驗，證明Δ6-脂肪酸脫氫酶融合蛋白具有免疫學活性。結果成功構建了重組酵母pGAPZαA-SMD1168，為利用基因工程菌生產γ-亞麻酸（GLA）奠定理論基礎。

深黃被孢霉；Δ6-脂肪酸脫氫酶；畢赤氏酵母SMD1168；pGAPZαA表達載體

0　引言

γ-亞麻酸（GLA）作為人體必需不飽和脂肪酸之一，具有降血脂、抗血栓等多種生物性功能［1-4］，在臨床上常被用于防治心梗、冠心病等多種疾病［5］。另有大量研究表明，GLA對多種藻類、G-菌以及一些G+菌生長有一定程度的抑制作用［6-9］。由于GLA在人類健康中的具有重要作用，而成為被人們關注的非常有價值產品，但是由于其產量、生產成本、安全性等問題，使現有來源不能滿足日益增長的市場需求。在脂肪酸代謝途徑中，Δ6-脂肪酸脫氫酶是合成PUFAs途徑過程當中的主要樞紐酶［10-11］，對人體具有非常重要的生理意義。近些年，隨著分子生物學與基因工程技術的飛速發展，利用此方法構建生產γ-亞麻酸的基因工程菌成為人們研究熱點［12］。因此，本試驗室選用適合外源蛋白表達的畢赤氏酵母SMD1168作為受體系統，采用pGAPZαA為表達載體，來探索生產γ-亞麻酸的新途徑。

1　材料

1.1菌株及質粒

試驗所用的畢赤氏酵母（Pichia pastoris SMD1168）菌株、深黃被孢霉（Mortieralla isabellina As3.3410）菌株以及E.coli DH5α'由黑龍江八一農墾大學食品學院微生物實驗室提供；兔抗D6D多克隆血清為實驗室自行制備；酵母蛋白表達載體pGAPZαA，質粒pMD18-T均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2工具酶、試劑與培養基

T4DNA連接酶、XhoⅠ酶、ECoRⅠ酶、DNA Marke購自寶生物工程（大連）有限公司；設計的引物由上海生工合成；常規生化試劑均為國產分析純。PDA培養基、LB培養基、含抗生素Zeocin酵母膏胨葡萄糖培養基YPDS參照文獻方法［13-15］。

2　方法

2.1D6D基因的克隆與鑒定

按照深黃被孢霉D6D基因的序列，并根據酵母蛋白表達載體pGAPZαA的多克隆位點進行引物設計，并在上游插入ECoRⅠ酶切位點、下游插入XhoⅠ酶切位點。最終設計的上下游引物如下：

引物P1：5'-GAA TTC GCC GCC ACC ATG GGT ACG GAC C-3'

引物P2：5'-CTC GAG CTC TTC CTT GGG ACG GAG-3'

以深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）基因的cDNA為模板，進行擴增目的基因片段。試驗方法：在95℃條件下，預變性5 min；在94℃條件下，繼續變性1 min；然后在55℃條件下，退火30 s；最后在72℃條件下延伸1.5 min，共計30個循環。用PCR純化試劑盒對D6D基因進行純化，取純化后的D6D基因與PMD18-T載體進行連接，從而構建克隆載體pMD18-T-D6D。

2.2大腸桿菌感受態細胞、酵母感受態細胞的制備與轉化

按常規方法［13］進行。

2.3酵母蛋白表達載體pGAPZαA-D6D的構建

用ECoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD18-T-D6D質粒，回收酶切片段，克隆到相同內切酶處理過的酵母蛋白表達載體pGAPZαA上，并轉化至制備好的感受態細胞，產物涂布在低鹽LB平板上，平板含25 μg/mL的抗生素Zeocin，在37℃條件下，培養16 h，直至呈現轉化菌落。取新鮮培養的轉化菌株，提取重組質粒，進行PCR，ECoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定重組質粒，陽性重組質粒命名為pGAPZαA-D6D。

2.4酵母細胞的轉化篩選與陽性克隆的PCR鑒定

取重組表達質粒pGAPZαA-D6D進行AvrⅡ酶切線性化，通過電轉化法（1 500 V，25 μF，200 Ω），將重組質粒 pGAPZαA-D6D電轉到畢赤氏酵母SMD1168中，取200 μL轉化產物涂在含Zeocin的YPDS平板上，在30℃下，培養2～10 d。篩選陽性酵母的單個菌落進行培養，收集液體培養基中的目標細胞，同時采用酸化玻璃珠的方法提取DNA基因組，利用PCR方法鑒定陽性重組克隆。

2.5重組蛋白的SDS-PAGE分析及Western bloting鑒定

將PCR檢測陽性單菌落接種于YPDS培養基中，15%Tricine-SDS-PAGE分析檢測上清液中蛋白的表達。通過轉印裝置將目的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，膜經10%脫脂乳室溫封閉1 h后，經1∶100倍稀釋的兔抗D6D多克隆血清于4℃下孵育過夜，經PBST緩沖液充分漂洗3次，每次5 min；再經1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫下孵育1 h，PBST緩沖液充分漂洗3次，每次5 min。將制備好的膜置入二氨基聯苯胺DAB-H2O2顯色液中，在避光的條件下顯色，直至出現條帶，隨后立刻將膜轉移到去離子水中終止顯色反應。

3　結果與分析

3.1深黃被孢霉D6D基因的PCR擴增結果

以深黃被孢霉D6D基因的cDNA為模板，利用設計的引物進行PCR。

PCR結果見圖1。

圖1　PCR結果

由圖1可知，目的基因在1 300 bp左右處出現一條明亮的條帶，其大小與目的片段大小基本一致。

3.2D6D基因重組質粒pGAPZαA-D6D的PCR與雙酶切鑒定

重組質粒pGAPZαA-D6D的PCR結果見圖2，重組質粒pGAPZαA-D6D的雙酶切結果見圖3。

圖2　重組質粒pGAPZαA-D6D的PCR結果

圖3　重組質粒pGAPZαA-D6D的雙酶切結果

結果分析表明，在1 300 bp處有一亮帶，與預期目的片段的大小相似。重組質粒經ECoRⅠ和XhoⅠ限制性酶雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。結果分析表明，在1 300 bp和3 000 bp處各有一條明亮的條帶，與預期目的片段的大小一致，證明已成功構建重組質粒pGAPZαA-D6D。

3.3重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR鑒定

篩選陽性重組克隆，提取重組酵母SMD1168的基因組DNA，利用PCR方法鑒定。

重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR結果見圖4。

圖4　重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR結果

由圖4可知，在1 300 bp左右處出現一條亮帶，與預期片段大小相符，可以證明重組深黃被孢霉D6D基因已整合到酵母SMD1168的染色體上。

3.4表達產物的SDS-PAGE分析及Western bloting鑒定

經PCR鑒定后的陽性重組子進行培養，通過Tricine-SDS-PAGE分析檢測上清液中蛋白的表達。

重組畢赤氏酵母SMD1168表達產物的SDSPAGE電泳見圖5，重組畢赤氏酵母SMD1168表達產物的Western bloting電泳見圖6。

圖5　重組畢赤氏酵母SMD1168表達產物的SDS-PAGE電泳

圖6　重組畢赤氏酵母SMD1168表達產物的Western bloting電泳

由圖5可知，在約70 kDa的位置有一條明顯的蛋白條帶，其分子量與D6D的理論值相符，而陰性對照菌株在相應處無明顯的蛋白條帶，說明D6D基因在畢赤氏酵母SMD1168中得到表達。對重組畢赤酵母表達產物進行Western bloting電泳，將其轉移到PVDF膜上進行免疫學反應，可以觀察到在約70 kDa處呈現了特異的蛋白質印跡帶，從而證明表達的重組蛋白具有良好的免疫學活性。

4　討論

本研究采用pGAPZαA為表達載體，SMD1168畢赤氏酵母為受體系統，來構建高效、分泌型的畢赤酵母表達系統。酵母表達系統相對于原核表達系統具有一定的優勢［16-17］，并且酵母菌與人類的關系十分密切，一般情況下沒有致病性。畢赤氏酵母組成型表達載體pGAPZα能生產比誘導型表達載體pPICZ和pPICZαA更高的外源蛋白，且不需要誘導，無毒性，操作簡單。深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在酵母SMD1168中表達未見報道。本試驗構建的重組酵母載體經電轉化到畢赤氏酵母SMD1168中，通過鑒定證明Δ6-脂肪酸脫氫酶融合蛋白具有一定的免疫學活性，說明通過酵母表達系統表達重組此蛋白是可行的。但是通過試驗發現，其蛋白的表達量不高，達不到工業生產的要求，后期將通過更換表達載體與優化表達條件等方法提高蛋白表達，為利用工程菌生產γ-亞麻酸奠定理論基礎。

［1］Begin M，Das U N.A deficiency in dietary gamma-linolenic acid or eicosapentaenoic acids may determine individual susceptivlity to AIDS［J］.Med Hypotheses，2006（20）：1-8.

［2］石克勛，牛增智.月見草油膠丸治療高脂血癥30例 ［J］.新藥與臨床，1990，9（1）：8-10.

［3］伶銘，江力，鄒競，等.月見草油膠囊治療高脂血癥 ［J］.中西醫結合雜志，1988（8）：469-471.

［4］杜笑逸，王義明.月見草油對實驗性高血脂及脂肪肝的影響 ［J］.中國藥學雜志，1991，26（10）：597-598.

［5］谷利偉，趙金蘭.共軛亞油酸研究進展 ［J］.糧油食品科技，2001，9（2）：28-29.

［6］杭曉敏，唐涌鐮，柳向龍.多不飽和脂肪酸的研究進展 ［J］.生物工程進展，2001，21（4）：18-21.

［7］Boudreau M，Chanmugan P S，Hart S B.Lack of dose response by dietary n-3 to n-6 fatty acid in suppressing eicosanoid biosynthesis from arachidonic acid［J］.AmJ Clinnurt，2004，54（1）：11.

［8］Ohta S，Chang T，Kawashima A，et al.Antibiotic activity of unsaturated fattyacids on methieillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Biosci Biotech Bio-chem，2003，57（12）：2 194-2 195.

［9］Ratledge C，Katuda Y.Technological advances and alternative sources of LiPids［J］.Blackie Aca Demic，2006，33：235-291.

［10］A Macartney，B Maresca，A R Cossins.Acyl-CoA desaturases and the adaptive regulation of membrane lipid composition［J］.Temperature Adaptation of Biological Membranes，Portland Press，London，1994，99：129-139.

［11］Sakkutadani E，Kobayashi M，Shimizu S.Δ6-fatty acid desaturase from an arachidonic acid-producing Mortierellafungus gene cloning and its heterologous expression in a fungus：Aspergillus［J］.Gene，1999，152：7-12.

［12］張琦，李明春，孫紅妍，等.Δ6-脂肪酸脫氫酶的分子生物學研究進展 ［J］.生物工程學報，2004（3）：319-324.

［13］J薩姆布魯克，E F佛里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南 ［M］.第2版.（金冬雁等譯）.北京：科學出版社，1993：174-186.

［14］邢來君，鐘輝，周輝，等.深黃被孢霉發酵生產γ-亞麻酸的研究 ［J］.真菌學報，1996，15（4）：272-277.

［15］王長遠，張麗萍，劉松財，等.甜味蛋白Brazzein在畢赤氏酵母中表達的初步研究 ［J］.中國食品學報，2009（5）：43-47.

［16］Sreekrishna K，Brankamp K E.Strategies for optimal synthesis and secretion and heterologous proteins in the methylotrophic yeast P.pastoris［J］.Gene，1997（1）：55-67.

［17］張惠展.基因工程 ［M］.上海：華東理工大學出版社，2005：37-48.◇

Study on the Expression of Mortieralla Isabellina Δ6-fatty Acid Desaturase Gene in the Pichia Pastoris Yeast SMD1168

WANG Changyuan，QUAN Yue，SHEN Binglei，YAO Di，YU Changqing
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Primers are designed based on Δ6-fatty acid desaturase（D6D） genes conserved region and pGAPZαA vector cloning sites.For primer design，downstream，respectively，introduced ECoRⅠand XhoⅠrestriction sites.From Mortierallaisabellina cloned Δ6-fatty acid desaturase gene（D6D） .D6D gene is cloned from Mortieralla isabellina，vector pMD18-TD6D with pGAPZαA-D6D.That recombination vector is obtained.After ligation of the plasmids by AvrⅡ，being integratedinto the genome of host yeast P.pastoris SMD1168 by electroporation and sereening the converter by Zeocin.To induce expression recombinant bacteria，and the Immunologic competence is detected with Tricine-SDS-PAGE and Western bloting.The Yeast pGAPZαA-SMD1168 plasmid is construeted suceessfully.For the mass production of GLA has laid a solid foundation.

Mortieralla isabellina；Δ6-fatty acid desaturase；Pichia pastoris SMD1168；expression vector pGAPZαA

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.030

2016-05-31

黑龍江省農墾總局科技攻關項目（HNK125A-04-16）。

王長遠（1976— ），男，博士，教授，研究方向為食品科學。