青錢柳種質資源親緣關系的ISSR分析評價

陳秀娟，柏明娥*，王麗玲，張都海，徐高福，王燕飛

(1.浙江省林業科學研究院，杭州310023；2.淳安縣新安江開發總公司，浙江淳安311700；3.龍泉市林場，浙江麗水323700)

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青錢柳種質資源親緣關系的ISSR分析評價

陳秀娟1，柏明娥1*，王麗玲1，張都海1，徐高福2，王燕飛3

(1.浙江省林業科學研究院，杭州310023；2.淳安縣新安江開發總公司，浙江淳安311700；3.龍泉市林場，浙江麗水323700)

利用ISSR分子標記，對從浙江、江西、湖南等地收集的38份青錢柳種質資源的親緣關系進行分析評價。結果表明：(1)從100對ISSR引物中篩選出16對，能擴增出108條多態性條帶，多態率為67.5%，表明青錢柳種質資源的種內變異較為豐富；(2)38份材料間的遺傳相似系數在0.118～0.667，浙江淳安姥山林場2號與江西修水1號遺傳相似系數最大為0.667，親緣關系最近；浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號遺傳相似系數最小為0.118，親緣關系最遠；(3)聚類分析表明在遺傳相似系數為0.330時可將38份青錢柳種質分為2組，第1組包括37個樣品，第2組僅包括浙江遂昌白馬山1號1個樣品；在遺傳相似系數為0.368時可將第1組再細分為2個小組，第1小組包括23個樣品，以浙江種質居多，第2小組包括14個樣品，以浙江遂昌和湖南種質為主。本研究結果從分子水平上反映了青錢柳不同地理種源間的變異程度和親緣關系，可以為合理引種、保護和優良種源篩選提供參考依據。

青錢柳；種質資源；親緣關系；ISSR

青錢柳[(Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinsk.)]系胡桃科(Juglaruiaceae)青錢柳屬植物，是冰川世紀幸存下來的珍稀樹種，為我國特有。青錢柳為落葉喬木，樹干通直，果實為堅果，扁球形，中部圍有水平方向的革質圓盤狀翅，形似銅錢，可作為速生用材及園林觀賞樹種[1]。青錢柳種子具有休眠特性，一般播種后需隔年萌發，自然萌發率低[2-3]。研究表明青錢柳中含有多種有機或無機類化學成分，如黃酮[4]、多糖[5]、三萜類化合物[6]、酚酸類化合物[7]及鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、硒等無機元素[8]，具有降血糖[9]、降血壓[10]、降血脂[11]和提高機體免疫力等多種功能[12]。青錢柳分布范圍較廣，主要分布于我國亞熱帶地區的江西、浙江、安微、福建、湖北、四川、貴州、湖南、廣西、重慶、江蘇等省(市)，河南、陜西和云南省也有少量分布，多生于海拔420～1100m(東部)或420～2500m(西部)的山區、溪谷、林緣、林內或石灰巖山地，喜生于溫暖、濕潤、排水良好的酸性紅壤、黃紅壤之上[13-14]。青錢柳在我省的安吉、杭州、臨安、淳安、建德、寧波、天臺、開化、仙居、遂昌、龍泉、慶元、云和、麗水、瑞安等地均有零星或小片狀分布[15]。隨著青錢柳藥用價值的開發，大規模掠奪式和破壞性采集資源現象嚴重，導致對自然植被不同程度的破壞，許多地區的青錢柳自然居群逐漸縮減，再加上青錢柳種子敗育率高，自然更新能力弱，在一定程度上也限制了其發展。因此對青錢柳種質資源的保存、保護非常重要。

青錢柳作為第三紀孑遺物種，起源古老，在長期進化過程中受地理環境等因素的自然選擇或人為選擇使種質間產生了一定的遺傳變異，這種遺傳變異不僅表現在物種形態上，同樣也體現在分子水平上。如佘誠棋等[16]的研究表明，青錢柳種子性狀在群體間和群體內均達到顯著差異，不同種源青錢柳復葉性狀、地徑和苗高均存在顯著差異[17]；周一碭等[18]的研究表明，青錢柳種質資源厙的遺傳多樣性豐富。DNA分子標記技術作為品種鑒別、物種間親緣關系分析等的一種有效手段，已在多種植物的研究中得到應用[19-21]。ISSR(inter-simple sequence repeats)是1994年由Zietkeiwitcz創建的一種簡單序列重復間擴增多態性分子標記方法[22]，具有操作簡單快捷、DNA用量少、技術要求和成本低等特點。本文利用ISSR分子標記技術對浙江、江西、湖南等地收集的38份青錢柳種質資源材料進行親緣關系的分析評價，以期為青錢柳種質資源的保存、保護及分子輔助選育提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試青錢柳種源分別采自浙江、江西、湖南、貴州等地(見表1)，其中19號、20號、21號分別為浙江淳安姥山林場、浙江安吉天荒坪和浙江遂昌白馬山母樹群采集種子后培育的1a生實生苗種源，其余均為自然分布種源。采樣時選取無病蟲害的幼嫩葉片，硅膠干燥封存后帶回實驗室于-70℃保存備用。

表1　供試青錢柳種源與采集地點

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取。基因組提取采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(BioTeke，北京)，DNA提取后通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000C 微量核酸蛋白測定儀檢測完整性、純度及濃度。D260 /D280 > 1. 8 的DNA 樣品用于后續 PCR 擴增。

1.2.2ISSR引物篩選和PCR的擴增。從38份樣品中選擇5份樣品進行ISSR引物篩選，共獲得16條擴增條帶清晰、穩定的多態性引物(見表2)。

表2　供試ISSR引物序列

利用這16條引物對38份青錢柳的DNA樣品進行 ISSR-PCR擴增。ISSR擴增反應采用20μL體系：10. 0μL 2×Power Taq PCR MasterMix，模板DNA 60 ng，ISSR 引物1μL (10μmol/L) ，ddH2O補足20μL。PCR擴增反應在杭州博日公司的TC-XP 型擴增儀上進行。ISSR-PCR 擴增程序為 94℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環，循環結束后72℃延伸7min，4℃保存。PCR樣品的分析采用毛細管電泳。

1.2.3數據處理與統計分析

PCR 擴增產物用毛細管電泳分析后，根據實驗結果，分析記錄同一大小重復出現的條帶，在相同的遷移大小上，有帶用1表示，無帶用0表示。采用 NTSYS-pc 2.10e 軟件進行遺傳多樣性分析，使用軟件中的SimQual程序計算樣品間的Dice遺傳相似系數，用SAHN程序進行UPGMA(非加權成對算術平均法)聚類分析，通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2　結果與分析

2.1擴增產物的多態性分析

利用篩選出的16條ISSR引物對青錢柳基因組DNA進行PCR擴增，毛細管電泳結果顯示均能擴增出清晰穩定、重復性和多態性較高的條帶。這16條引物共擴增獲得160條ISSR條帶，條帶大小介于100～1000 bp，其中多態性條帶數108條，多態率為67.5%，表明38個青錢柳種質間的基因組差異明顯，種內變異較為豐富。

圖1　引物820對4號青錢柳樣品的擴增圖譜

2.2遺傳相似性分析

將16條引物擴增出的條帶作為原始矩陣，利用 NTSYS-pc 軟件計算38份種質間的 Dice 遺傳相似系數，遺傳相似系數介于0.118～0.667，平均為0.409。其中浙江淳安姥山林場2號與江西修水1號之間的遺傳相似系數最大為0.667，表明兩者間的親緣關系最近；其次為浙江富陽2號與4號，遺傳相似系數為0.647。親緣關系最遠的為浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號，遺傳相似系數最小為0.118，其次為湖南綬寧與浙江安吉天荒坪4號，遺傳相似系數為0.151。38份試樣間的遺傳相似系數詳見表3。

表3　38份青錢柳種源間的遺傳相似系數

接表3　38份青錢柳種源間的遺傳相似系數

2.3聚類分析

圖2　青錢柳種質資源UPGAM聚類圖

利用UPGMA法對38份青錢柳材料進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖(圖2)。在遺傳相似系數為0.330時可將38份青錢柳樣品分為2組，第1組包括37個試樣，第2組僅包括15號浙江遂昌白馬山1號1個試樣，在遺傳相似系數為0.368時可將第1組37份試樣再細分為2個小組，第1小組包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、27、28、29、33、34、35、37、38號共23個試樣，本組以浙江種源居多，浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪、杭州午潮山、寧波四明山等地種源全部歸于此組，另江西修水1號和2號、浙江開化古田山2號、浙江淳安姥山林場1號和2號、浙江遂昌1年生苗及貴州榕江平陽的種源也歸于此組；第2小組包括16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、30、31、32、36號共14個試樣，主要以浙江遂昌和湖南等地種源為主，另包括浙江淳安姥山林場3號和4號、浙江淳安姥山林場1年生苗、浙江安吉天荒坪1年生苗、開化古田山1號、江西中源種源。從以上聚類結果可以看出，來自相同地區的青錢柳樣品大都聚于一起，如浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪等，呈現出一定的地域性分布規律，但各地種源并未嚴格按地理界限聚在一起。

3　結論與討論

青錢柳作為一種很有發展前景的多用途珍貴樹種已引起人們極大的關注，相關研究及報導較多，但有關分子生物學方面的研究尚少。本研究利用ISSR分子標記技術從基因組水平揭示了青錢柳種質資源的遺傳差異及親緣關系，進而分析其遺傳多樣性，有助于青錢柳種質資源的保護。從ISSR-PCR擴增結果看，16對引物共擴增獲得160條ISSR條帶，多態性條帶百分率達67.5%，表明青錢柳在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性。遺傳相似性系數是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數，平均相似系數越高，說明相似程度越大，遺傳背景一致性越強[23]。分析結果表明38份青錢柳種質的遺傳相似性系數在0.118～0.667，平均為0.409，其遺傳相似性系數總體比較低，說明青錢柳種質在長期的適應和進化過程中形成了廣泛的遺傳變異，個體間遺傳差異較大。38份種質中親緣關系最近的為江西修水1號與淳安姥山林場2號，遺傳相似系數最大為0.667，親緣關系最遠的為浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號，遺傳相似系數最小為0.118，青錢柳種質間親緣關系的遠近與地理距離間沒有形成一定的相關性。

進一步的聚類分析表明來自相同或相近地區的多數種質可以聚于一起，如浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪、杭州午潮山、寧波四明山等地的種質基本聚于一組，呈現一定的地域性分布規律，表明這些地區的種質相似度較高，遺傳背景較為一致。但各地種質并未嚴格按地理界限聚在一起，出現一定的交叉現象，如江西修水、貴州榕江平陽的種質與上述種質聚于一組，湖南綏寧、湖南張家界種質基本與浙江遂昌種質聚為一組，這可能與種質資源的自然遷移或人工移栽等因素有關。值得關注的是，聚類圖顯示位于浙江遂昌境內的白馬山1號種質單獨聚為一組，提示該種質在遺傳背景上可能與其它種質存在較大程度的差異。因此，可考慮進一步開展該種質的生物學性狀、化學成分等方面的研究，為青錢柳優良種源選擇和推廣應用提供一定的理論依據。

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2016-04-10

浙江省科技廳公益技術研究農業項目(2013C32087)；遂昌縣科技計劃項目(2014-17-08)

陳秀娟(1973- )，女，助理工程師，主要從事林業資源管理；*通訊作者：柏明娥(1966- )，女，研究員，碩士，主要從事資源植物開發利用技術研究，E-mail:1683317628@qq.com。

S792.12

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.002