油菜素內酯對巨桉組培中不定根誘導、苗木生長和莖基部細胞結構的影響

閆慧芳，曾炳山，范春節，劉　英，裘珍飛，李湘陽

( 中國林業科學研究院 熱帶林業研究所，廣州 510520 )

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油菜素內酯對巨桉組培中不定根誘導、苗木生長和莖基部細胞結構的影響

閆慧芳，曾炳山，范春節*，劉英，裘珍飛，李湘陽

( 中國林業科學研究院 熱帶林業研究所，廣州 510520 )

以巨桉優良無性系EG5和GL1組培苗為材料，在生根培養基中分別加入0、 0.005、0.01、0.05、0.10、0.20 mg·L-1的油菜素內酯，研究其對桉樹組培苗中不定根的誘導、莖的生長以及莖基部細胞分化的影響。結果表明：油菜素內酯對巨桉無性系EG5的生根率和苗高具有顯著影響，無性系EG5在含有0.005 mg·L-1油菜素內酯的生根培養基中達到最高為76.6%的生根率，同時組培苗的苗高隨著油菜素內酯濃度的增加而呈現出逐漸降低的趨勢。對于巨桉無性系GL1，在生根培養基中添加0.05 mg·L-1油菜素內酯達到最高為88.3%的生根率，不同濃度的油菜素內酯對苗高沒有顯著影響。同時也發現油菜素內酯明顯抑制了無性系EG5不定根的根長，隨著其濃度的增加根長逐漸變短；而根條數表現為低濃度時無顯著影響，在高濃度時顯著性降低，且油菜素內酯對側根的誘導和分化不起作用。另外通過對無性系EG5生根植株基部的組織切片和化學染色分析表明，油菜素內酯在0.10 mg·L-1時能促進桉樹基部的形成層和木質部的分化，這可能是抑制不定根誘導和分化的原因之一。

油菜素內酯, 桉樹, 不定根誘導, 形成層

油菜素內酯(Brassinosteriods，BRs)是廣泛存在于植物中一種甾醇類化合物，作為一種類固醇類激素，在植物生長發育中起著不可缺少的作用。早期的研究發現通過外施BRs可明顯促進胚軸的伸長、提高農作物產量、提高植物抗逆性和果蔬的生長(候雷平和李梅蘭, 2001; 束紅梅等, 2011)。在火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、挪威云杉(Piceaabies)、佛羅里達榧樹(Torreyataxifolia)和水稻(Oryzasativa)的體胚誘導過程中發現添加不同濃度的BRs可以促進胚性細胞的誘導和進一步的分化(Ma et al, 2012; Pullman et al, 2003)。另外在培養基中添加不同濃度的BRs有助于狐米草(Spartinapatens)愈傷組織的誘導和植株再生(Lu et al, 2003)，而以煙草(Nicotianatabacum)葉片為外植體進行愈傷組織誘導和植株再生中進一步證實了BRs的作用(Song-Lim Kim, 2008)。

BRs除了參與到種子萌發、矮化、黑暗中光周期響應、改變氣孔分布、延遲開花、雄性不育等發育過程中(Zhu et al, 2013)，而且還在細胞伸長和細胞壁擴展中起到重要作用(候雷平和李梅蘭, 2001)。在百日草葉肉懸浮細胞培養時加入BRs可以誘導維管組織的分化，同時在菊芋(Helianthustuberosus)中也發現BRs可以在體外誘導木質部的分化(Clouse, 1996; Fukuda, 1997)。在木本植物中發現BRs可以誘導日本山楊和美洲鋸齒白楊雜交種(Populussieboldii×P.grandidentata)愈傷組織中導管的形成，而且這些導管分子具有典型的次生木質部(Yamagishi et al, 2013)。研究也發現BRs能夠引起鵝掌楸(Liriodendrontulipifera)中纖維和導管長度的增加，促進細胞分裂和延伸，引起木質素合成基因的下調(Jin et al, 2014)。盡管如此，BRs對植物根發育的作用研究較少，尤其是對木本植物不定根發育的影響幾乎未見有報道。

本研究通過外源施加BRs到桉樹生根培養中，研究油菜素內酯對桉樹不定根誘導的影響，旨在為木本植物不定根的誘導提供新的思路。同時通過對桉樹生根苗莖基部組織化學分析，確定BRs對桉樹莖基部細胞結構的影響，進一步了解其對桉樹莖生長發育的作用。

1　材料與方法

1.1 材料

采用在增殖培養基(改良的MS培養基+0.50 mg·L-16BA+0.10 mg·L-1NAA)上培養15 d的巨桉無性系EG5和GL1無菌增殖苗，選擇生長健壯、苗高約為1.50 cm的增殖芽苗進行生根實驗。

1.2 桉樹生根實驗

材料為巨桉無性系EG5和GL1組培生根苗。分別采用改良的1/2MS培養基+1.00 mg·L-1IBA，同時加入0、0.005、0.01、0.05、0.10、0.20 mg·L-1表油菜素內酯，每個處理10～15瓶，每瓶10～15株。20 d調查生根率、苗高和生長狀況。

對于桉樹根長和根條數選擇巨桉無性系EG5，在生根培養基中30 d后測量最長根的根長、根條數和是否有側根。

1.3 植物組織切片

選擇對照和添加0.10 mg·L-1BRs生根培養基上培養30 d的巨桉EG5的基部，切取3～5 mm的莖段，立即浸入FAA固定液，抽氣 2次，每次15 min，室溫下固定24 h以上。然后依次通過逐級脫水至100%叔丁醇, 每級1.5～2 h。最后一次加入與叔丁醇等體積的石蠟，60 ℃放置24 h，期間用純石蠟替代4次。然后進行包埋、固定和修塊，切片時采用滑走切片機切出12 μm厚度的切片,在45 ℃溫箱中過夜烤片。經過脫蠟后甲苯胺藍O(TBO)滴染約1 min，漂洗，甘油封片，顯微鏡觀察拍照。

1.4 統計分析

應用SPSS和EXCEL軟件對生根苗各項指標進行方差分析和多重比較，多重比較采用LSD最小顯著性差異法(P<0.05)，生根率在進行方差分析前采用反正弦轉換。

2　結果與分析

2.1 BRs在巨桉無性系不定根誘導中的作用

不同濃度的BRs對巨桉的生根率具有顯著性影響(圖1)，在無性系GL1中，隨著BRs濃度的增加，桉樹的生根率呈現不同程度的增加，在外施BRs濃度為0.05 mg·L-1時達到最高(88.3%)。在無性系EG5中，外施不同濃度的BRs對其生根率的影響也達到顯著水平，在外施BRs較低時如0.005、0.01和0.05 mg·L-1時，EG5的生根率顯著性增加；在BRs濃度為0.005 mg·L-1時，EG5的生根率達到最高(76.6%)。從圖1可以看出，在濃度超過0.10 mg·L-1的培養基中，EG5的生根率顯著下降，當培養基中BRs的濃度為0.20 mg·L-1時，EG5的生根率達到最低，為34.1%，明顯低于對照的57.0%，說明高濃度的BRs抑制了桉樹不定根的誘導。

圖 1　不同濃度的油菜素內酯對巨桉無性系生根率的影響同一個無性系中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Fig. 1　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the rooting rate of clone E. grandis　Different small letters in the same column represent significant differences (P<0.05). The same below.

圖 2　不同濃度油菜素內酯對巨桉生根苗高度的影響Fig. 2　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the shoot height of E. grandis

2.2 BRs對巨桉苗高的影響

通過對不同濃度BRs處理的巨桉無性系EG5和GL1的生根苗高度進行測量，圖2結果表明EG5和GL1對不同濃度BRs響應不同。外施BRs抑制了EG5的生長，芽苗的抽高受到明顯抑制，在0.10 mg·L-1時達到了最低(1.57 cm)，與對照相比降低了21.8%。而施加不同濃度的BRs到無性系GL1發現其對生根苗高度上的影響不顯著。盡管如此，仍然可以看到在加入BRs后苗高略微下降。可能是由于不同無性系之間由于莖基部結構的差異導致其對油菜素內酯的響應濃度和響應方式的不同。

2.3 BRs對EG5不定根根長和根條數的影響

由于在生根實驗中發現BRs對EG5生根率和高度上的影響，為了弄清是否由于根生長受到抑制引起生長上的抑制，因此對EG5的根長和根條數進行了進一步的研究。從圖3可以看出，在30 d的生根培養基上，發現隨著BRs濃度的增高，根長出現明顯下降。在沒有添加BRs的培養基中，平均根長為4.64 cm；而在濃度為0.20 mg·L-1的生根培養基中平均根長只有2.49 cm，說明BRs抑制了EG5不定根的伸長，這可能是BRs抑制桉樹生根苗抽高的主要原因之一。

圖 3　油菜素內酯對巨桉EG5根長的影響Fig. 3　Effects of different concentrations of brassinosteriod on root length of E. grandis clone EG5

圖 4　油菜素內酯對巨桉EG5根數量的影響Fig. 4　Effects of different concentrations of brassinosteriod on the root number of E. grandis clone EG5

圖 5　巨桉EG5生根苗基部切片分析　 A. 對照; B. 0.10 mg·L-1 BR。線狀比例尺為0.10 mm。Fig. 5　Histochemical analysis of basal stem of E. grandis clone EG5　A. Control； B. 0.10 mg·L-1 brassinosteriod. Scale bar=0.10 mm.

在此基礎上，進一步對外施BRs(濃度為0.005和0.01 mg·L-1)，并對不定根數量進行了分析。從圖4可以看出，與對照相比，不定根的數量無明顯變化，說明低濃度BRs對EG5不定根誘導作用不顯著。而隨著BRs濃度的進一步增高，不定根的數量明顯降低，由原來的平均在3條以上降低到2條以下。這些與BRs在高濃度時引起巨桉生根率降低的結果相一致，說明高濃度的BRs明顯抑制了不定根的誘導和形成。除此之外，通過對生根苗中側根的誘導統計，所有處理的不定根都有側根出現。這表明BRs主要通過影響桉樹不定根的誘導和發育來進一步作用于桉樹的生長。

2.4 BRs對桉樹莖基部初生木質部分化的影響

在上述研究中發現，高濃度BRs抑制了桉樹不定根的誘導，為了進一步了解其機制，因此對莖基部進行了細胞結構分析。在外施BRs(濃度在0.10 mg·L-1)中發現，BRs引起桉樹基部膨脹作用最為明顯，因此在本研究中選擇外施BRs，當外施BRs的濃度在0.10 mg·L-1時，對EG5生根苗莖基部取樣進行石蠟切片分析。從圖5可以看出，與對照相比，韌皮部細胞數量變少，細胞變小，而薄壁細胞數量明顯增加，且細胞變小，同時薄壁細胞連接起來，甚至出現導管，已經具有明顯的次生生長，另外在圖5中還可以明顯看到木質部細胞明顯增加。

3　討論與結論

本文通過在桉樹生根培養基中添加不同濃度的BRs研究其對桉樹不定根誘導、苗高以及桉樹莖基部細胞結構的影響。結果表明低于0.05 mg·L-1的BRs可以不同程度地提高桉樹的生根率，且對植株的高度生長影響較小甚至不受影響。因此可以通過添加適當濃度的BRs來改善和提高木本植物組培過程中的不定根誘導困難的問題，這為解決木本植物生根率低的問題提供一種解決方式。

值得注意的是0.10 mg·L-1的BRs會明顯地抑制不定根的誘導。經過切片分析，0.10 mg·L-1的BRs引起桉樹基部的形成層細胞增多，且木質化程度增加。這些結果與BRs誘導百日草懸浮細胞形成導管以及BRs會引起楊樹愈傷組織誘導次生木質部的形成結果一致(Fukuda, 1997; Yamagishi et al, 2013)，說明BRs對桉樹組培苗莖基部木質化細胞的誘導和分化起作用。在白樺(BetulaPlatyphylla)不定根誘導的過程中對不定根起源研究時發現，不定根起源于幼莖內部少數維管射線細胞與形成層的交叉處加寬的部位(詹亞光等, 2002)，而在本研究中發現0.10 mg·L-1的BRs引起桉樹基部形成了環狀的形成層，意味著進入了次生生長，在此過程中單獨的成團細胞減少，引起誘導不定根的條件減少。說明桉樹莖基部的木質化增加可能是不定根誘導受到抑制的主要原因之一。

除此之外，在研究中發現添加BRs明顯地抑制了不定根的伸長，與小麥和綠豆中的作用類似(Roddick & Ikekawa, 1992)。而在擬南芥中發現BRs在低濃度時仍然能夠促進根的伸長(Müssig et al, 2003)，但會抑制根毛的發育。與之不同，在水稻中BRs表現出在一定的濃度范圍內促進根毛的生長發育(王鳳茹和董金皋, 2010)。因此推測BRs對不定根發育的影響受到劑量調控，不同物種響應BRs的濃度不同從而導致其對根發育的影響不同。

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Adventitious root induction, shoot height and cellular structure of basal stem by exogenous application of brassinosteriod inEucalyptusgrandis

YAN Hui-Fang, ZENG Bing-Shan, FAN Chun-Jie*,LIU Ying, QIU Zhen-Fei, LI Xiang-Yang

( Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China )

Brassinosteroids (BRs) refer to a group of polyhydroxylated plant steroid hormones that are essential regulators of plant architecture, growth and development including embryogenesis, cell division, vascular system differentiation and stress tolerance processes. However, the effects of BRs in adventitious root induction ofEucalyptushave not been demonstrated. In this study, adventitious root induction, growth of shoots and histochemical staining of basal stem were analyzed by adding the exogenous brassinosteriod (Concentration: 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.10, 0.20 mg·L-1,respectively) in the root inducing medium ofE.grandisclones EG5 and GL1. The results showed that the height of shoot and induction frequency of adventitious root ofE.grandisclone EG5 were significantly affected by adding the exogenous brassinosteriod. Induction frenquency of adventitious root was 76.6%. The length of adventitious root ofE.grandisclone EG5 was the highest in the root inducing medium containing 0.005 mg·L-1brassinosteriod for. In the meantime. The height of shoot decreased significantly with the increasing concentration of exogenous brassinosteriod and it was reduced by 21.8% at 0.10 mg·L-1brassinosteriod concentration compared to control. The adventitious root induction frequency ofE.grandisclone GL1 reached the highest level with 88.3% in the root inducing medium of adding 0.05 mg·L-1brassinosteriod concentration but the height of shoot showed no significant change by adding the exogenous brassinosteriod. It was interesting that the root elongation ofE.grandisclone EG5 was significantly inhibited due to the addition of the exogenous brassinosteriod. Root length and number were reduced to 2.49 cm and 1.75 at 0.20 mg·L-1brassinosteriod from 4.64 cm and 3.02(control) respectively. However, the lateral root induction and differentiation were not affected by adding the exogenous brassinosteriod. Besides, the growth in xylary cells of basal stem was clearly promoted and the cambium cell number of basal stem increased at 0.10 mg·L-1brassinosteriod by way of the histochemical analysis. Together, brassinosteriods was necessary to adventitious root induction and shoot growth and increasing xylem was a primer cause of lower frenquency of adventitious root induction at a few extra brassinosteriod.

brassinosteriod,Eucalyptusgrandis, adventitious root induction, cambium

10.11931/guihaia.gxzw201412005

2015-03-16

2016-01-25

國家自然科學基金(31400554)；國家科技計劃項目(2013AA102705)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(RITFYWZX201304)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31400554); Project of National Science and Technology Plan(2013AA102705); Special Foundamental Research Fund of the Central Research Institutes of Public Benefit (RITFYWZX201304)]。

閆慧芳(1987-)，男，陜西渭南人，碩士研究生，研究方向為分子遺傳學，(E-mail)huifangy@sina.com。

范春節，博士，助理研究員，從事木材形成分子機理研究，(E-mail)fancy0417@163.com。

Q943

A

1000-3142(2016)07-0763-05

閆慧芳，曾炳山，范春節，等. 油菜素內酯對巨桉組培中不定根誘導、苗木生長和莖基部細胞結構的影響[J]. 廣西植物，2016，36(7)：763-767

YAN HF,ZENG BS,FAN CJ，et al. Adventitious root induction, shoot height and cellular structure of basal stem by exogenous application of brassinosteriod inEucalyptusgrandis[J]. Guihaia，2016，36(7)：763-767