廣西普通油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析

張恩慧，王曉云，覃子海，趙文東，韋長江，王鵬良*

( 1. 江西中醫(yī)藥大學 江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330004； 2. 廣西林業(yè)科學研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西特色經(jīng)濟林開發(fā)和利用重點實驗室，南寧 530002； 3. 廣西國有三門江林場，廣西 柳州 545006 )

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廣西普通油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析

張恩慧1，王曉云1，覃子海2，趙文東3，韋長江3，王鵬良2*

( 1. 江西中醫(yī)藥大學 江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330004； 2. 廣西林業(yè)科學研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西特色經(jīng)濟林開發(fā)和利用重點實驗室，南寧 530002； 3. 廣西國有三門江林場，廣西 柳州 545006 )

普通油茶(Camelliaoleifera)是我國分布最廣、產(chǎn)量最多的山茶屬中一個重要油料樹種。廣西是普通油茶的重要分布區(qū)，種質(zhì)資源十分豐富。為深入了解廣西普通油茶種質(zhì)資源的遺傳變異，服務于種質(zhì)保存和品種選育，該研究首先對已開發(fā)的SSR分子標記進行多態(tài)性篩選和評價，在此基礎上利用多態(tài)性較高的引物，對97份廣西有代表性的普通油茶種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：(1) 在已開發(fā)的10對油茶SSR分子標記中，7對能穩(wěn)定擴增且表現(xiàn)為共顯性，2對擴增不穩(wěn)定，另外1對無法擴增出產(chǎn)物。(2) 7對共顯性SSR標記總共檢測到33個等位基因，每對標記檢測到等位基因數(shù)目的變化范圍為3～6個，平均每個位點等位基因數(shù)為4.714 3個，有效等位基因數(shù)目的變化范圍為2.084 2～4.314 8，平均有效等位基因數(shù)為2.828 8；基因多樣性變化范圍為0.520 2～0.768 2，平均每個位點基因多樣性為0.628 1。(3) 參試群體中絕大多數(shù)位點未處于Hardy-Weinberg平衡，存在遺傳結(jié)構(gòu)；觀測雜合度和期望雜合度的變化范圍分別為0.413 0～0.670 1和0.523 3～0.772 4，其平均值分別為0.569 8和0.631 6。(4) 種質(zhì)資源間遺傳距離變化范圍為0.05～0.791 7，平均遺傳距離為0.354 5；UPGMA聚類顯示相同來源的種質(zhì)資源無法聚成一類，在同一聚類分支上混有不同來源的種質(zhì)資源。這表明已開發(fā)的油茶SSR分子標記適用于廣西普通油茶，廣西普通油茶種質(zhì)資源擁有較豐富的遺傳多樣性。該研究結(jié)果為廣西普通油茶資源的深度開發(fā)和高效利用提供了科學依據(jù)。

普通油茶, SSR標記, 遺傳多樣性, 遺傳結(jié)構(gòu), 復等位基因

油茶是山茶屬種子含油量高、有栽培價值物種的統(tǒng)稱(陳永忠等, 2005a)。普通油茶(Camelliaoleifera)是油茶中分布面積最廣、 總產(chǎn)量最多的一個物種，常用于榨取高質(zhì)量的食用茶油；此外，榨油剩余物可進一步加工，用作化工、紡織和農(nóng)藥等行業(yè)的原材料。其用途廣、價值高(姚小華等, 2012)。油茶是我國特有的重要油料樹種，主要分布于我國南方18個省市區(qū)(莊瑞林, 2007)。目前，普通油茶的遺傳多樣性研究逐漸開展。陳永忠等(2005b)利用RAPD (Rapid Amplified Polymorphic DNA)標記鑒定油茶湘林系列的優(yōu)良無性系；林萍等(2010)和彭紹峰等(2011)分別利用SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism)標記對長林系列12個優(yōu)良無性系和14個高產(chǎn)良種開展分子鑒定；黃永芳等(2006)利用RAPD技術(shù)對湖南、廣東和廣西三省(區(qū))的部分油茶種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析；王保明等(2008)和于小玉等(2013)分別利用ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)技術(shù)對湖南和湖北等部分品種開展遺傳多樣性分析；張婷等(2011a,b)分別利用SRAP和AFLP (Amplifed Fragment Length Polymorphism)兩種標記分別對湖北野生油茶資源開展遺傳多樣性研究，這為普通油茶遺傳資源的開發(fā)奠定了堅實基礎。

廣西是油茶的最重要產(chǎn)區(qū)之一，種質(zhì)資源十分豐富(張乃燕, 2003)。然而，到目前為止，僅見王鵬良等(2014)利用SRAP分子標記對廣西普通油茶的遺傳多樣性開展初步分析。SRAP標記是顯性分子標記。與RAPD、ISSR、SRAP和AFLP4種顯性分子標記相比，SSR為共顯性標記，能區(qū)分純合子和雜合子，而且能檢測復等位基因，在遺傳多樣性檢測中更具優(yōu)勢。為了更加深入地了解廣西普通油茶的遺傳變異，本研究采用已開發(fā)的油茶SSR分子標記對廣西普通油茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性開展研究，為廣西普通油茶種質(zhì)資源更加合理、高效地開發(fā)利用提供了可靠的科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

從廣西各地搜集的具有代表性的97份普通油茶種質(zhì)資源，均種植于柳州市城中區(qū)柳東鄉(xiāng)廣西國有三門江林場三門江分場的湖廣坪林區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 普通油茶基因組DNA提取以97份種質(zhì)資源的嫩葉為材料，利用改良的CTAB-SDS法(何衛(wèi)龍等, 2013)提取普通油茶基因組DNA，并稀釋成20 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱，待用。

1.2.2 PCR反應及產(chǎn)物檢測PCR反應體系參照王鵬良等(2014)：模板DNA 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 × Buffer 1 μL，10 mmol·L-1上下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶1.5 U，用ddH2O補足到10 μL體系。SSR反應程序參照彭嬋等(2013)：預變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 30 s (Δ ℃=-1 ℃)，延伸72 ℃ 45 s，9個循環(huán)；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 30 s，21個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應結(jié)束后，在effendorf管中加入6×Loading buffer 2 μL，混合均勻，吸取2 μL在8.0%聚丙烯胺凝膠上180 V電壓下電泳1.5 h，再進行快速銀染，顯影，照相。

1.2.3 SSR引物多態(tài)篩選及群體擴增從97個參試樣本中隨機抽取8個樣本作為模板，對彭嬋等(2013)的10對引物(表1)進行多態(tài)性篩選。在此基礎上，將篩選到的多態(tài)引物用于群體的擴增。

1.3 譜帶記錄和數(shù)據(jù)分析

同一引物擴增的遷移率相同的為同一等位基因，據(jù)此原則，對所得圖片進行人工讀帶，從小到大按照A，B，C，D，E……進行記錄，將擴增所得的純合子用相同字母表示，例如記為“AA”或“BB”，將雜合子用不同字母表示，例如記為“AB”。利用PopGene 1.32軟件分析等位基因變異總數(shù)(A)，有效等位基因數(shù)(Ne)，觀測雜合度(Ho), 期望雜合度(He), 固定指數(shù)(F)及Hardy-Weinberg平衡檢測；利用PowerMarker V3.25軟件(Liu & Muse, 2005)計算基因多樣性(H)，多態(tài)信息含量指數(shù)(Polymorphism Information Content, PIC)，樣本間的遺傳距離，按照非加權(quán)類平均法(unweighted pair-group method using arithemtic average, UPGMA)進行樣本間的聚類分析，利用MEGA6.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件生成聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選和評價

本研究根據(jù)彭嬋等(2013)已發(fā)表的10對油茶SSR序列信息合成引物，在參試群體中隨機抽取8個樣本作為模板開展多態(tài)引物篩選。結(jié)果表明7對引物能穩(wěn)定擴增出產(chǎn)物，且呈多態(tài)性，表現(xiàn)為共顯性，另2對(NJFUC57和NJFUC129)擴增不穩(wěn)定(表1)，僅有1對引物(NJFUC69)無法擴增出產(chǎn)物。

2.2 遺傳多樣性分析

從表2可以看出，7對引物總共檢測到33個等位基因，每個位點等位基因數(shù)目變化范圍為3～6，其中NJFUC53、NJFUC157和NJFUC833為6個等位基因，NJFUC787為3個等位基因，平均每個位點等位基因數(shù)目為4.714 3；有效等位基因數(shù)最高為4.314 8(NJFUC157)，最低值為2.084 2(NJFUC273)，平均有效等位基因數(shù)為2.828 8；基因多樣性的變化范圍為0.520 2～0.768 2，平均每個位點的基因多樣性為0.628 1；多態(tài)信息含量(PIC)的變化范圍為0.475 1～0.731 8，平均每個位點的多態(tài)信息含量為0.573 7。

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)和雜合度分析

表3結(jié)果表明，7個位點中，6個SSR位點不處于Hardy-Weinberg平衡，僅1個位點處于Hardy-Weinberg平衡，這表明參試群體存在遺傳結(jié)構(gòu)。同時利用SSR標記檢測了觀測雜合度和期望雜合度，它們的變化范圍分別為0.413 0～0.670 1和0.523 3～0.772 4，平均每個位點的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.569 8和0.631 6。通過對固定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NJFUC53、NJFUC273、NJFUC787和NJFUC833四個位點的固定指數(shù)F值為負數(shù)，其余3個位點的固定指數(shù)F值為正數(shù)。其中，NJFUC53、NJFUC157、NJFUC601 3個位點的數(shù)值較大。NJFUC53的固定指數(shù)F值(表3)表明，該位點雜合子過多；NJFUC157和NJFUC601表明這2個位點純合子過多；其余4個位點純合子和雜合子比例與期望比例接近。固定指數(shù)的平均值為0.076 4，說明純合子略多，但接近Hardy-Weinberg平衡。

2.4 遺傳距離和聚類分析

根據(jù)7對SSR標記擴增得到的遺傳信息，采用PowerMarker V3.25計算研究種質(zhì)資源之間的遺傳距離，種質(zhì)資源間最大的遺傳距離為0.791 7，最小的遺傳距離為0.05，平均遺傳距離為0.354 5。在種質(zhì)資源間遺傳距離最大的有3對，分別是56(FM)與111(BS)、56(FM)與146(G)、93(SBL)與155(BS)；距離最小遺傳的為33(LN)與164(QS)。在對97份種質(zhì)資源遺傳距離計算的基礎上，按照UPGMA方法對參試種質(zhì)資源開展聚類分析，再利用MEGA6.0軟件生成聚類圖。從圖1可以看出，相同來源的種質(zhì)資源不能很好地聚類成一個分支，同時在同一聚類分支上還混有一個或多個不同來源的種質(zhì)資源，從而形成了復雜的遺傳關系。

3　討論

SSR分子標記重復性好、呈共顯性、分布均勻且能檢測復等位基因(Varshney et al, 2005)。但油茶中SSR分子標記開發(fā)和應用的研究進展緩慢，范小寧等(2011)建立了油茶SSR的反應體系，史潔等(2012)和溫強等(2013)分別分析油茶不同轉(zhuǎn)錄組的SSR分布特征，但未開發(fā)SSR分子標記。目前，僅彭嬋等(2013)實質(zhì)上利用SSR對湖北油茶種質(zhì)的遺傳多樣性開展了研究。將彭嬋等(2013)報道的SSR標記用于本研究，發(fā)現(xiàn)10對SSR引物中，2對擴增不穩(wěn)定，1對無法擴增出產(chǎn)物。這可能由于引物結(jié)合位點的缺失、插入、替換等突變或不同引物擴增效率不同造成的(Saha et al, 2004)。

表 1　本研究所用引物序列Table 1　Primer sequences used in this study

表 2　遺傳多樣性信息Table 2　Information of genetic diversity

7對穩(wěn)定、多態(tài)的共顯性SSR標記總共檢測到33個等位基因，每個位點等位基因數(shù)目為3～6個，平均等位基因數(shù)目為4.714 3，存在較豐富的遺傳多樣性；但與陳贏男等(2014)和彭嬋等(2013)的報道相比，本研究等位基因數(shù)目相對略少，這可能由于所研究材料來自多個省，遺傳基礎較寬所致。

表 3　遺傳結(jié)構(gòu)和雜合度信息Table 3　Information of heterozygosity and genetic structure

注：**表示似然比檢測達極顯著水平，*表示似然比檢測達顯著水平。

Note: **denote significant level at 0.01 probability; *denote significant level at 0.05 probability.

通過對本研究參試的種質(zhì)資源開展Hardy-Weinberg平衡檢測，發(fā)現(xiàn)NJFUC787位點處于平衡狀態(tài)，而其余6位點均處于不平衡狀態(tài)。這說明參試群體總體上存在遺傳結(jié)構(gòu)，很可能是由于在種質(zhì)資源收集過程的選擇因素造成的。本研究的平均觀測雜合度為0.573 7，期望雜合度為0.631 6，盡管比之前的報道(彭嬋等, 2013)略低，也反映出了普通油茶的雜合度較高。這與油茶異交的交配特性相吻合(向暉等, 2013; 莊瑞林, 2007)，也是普通油茶雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的基礎。同時，不同位點間的觀測雜合度、期望雜合度及固定指數(shù)F都表明，位點間存在不同的選擇壓力。在不同的選擇壓力下，位點的進化速度也不相同。因此，盡管本研究所用的材料基本一致，但聚類結(jié)果與SRAP標記(王鵬良等, 2014)有較大差異，這可能與SSR分子標記有關，SSR標記的多態(tài)是由滑動和重組兩個主要原因產(chǎn)生的，另外伴隨突變，SSR的進化比較復雜，因此不一定能很好地反映出油茶的親緣關系(Ellegren, 2004; Li et al, 2002)。但仍然有一點與SRAP標記結(jié)果一致，即種質(zhì)資源聚類結(jié)果無法與種源相匹配。

圖 1　參試材料的聚類圖　LN. 立農(nóng)； DY. 都陽； FL. 富林； HB. 黃寶； ZP. 古袍； FM. 楓木； TM. 鐵帽； PL. 平樂； RY. 仁勇； BY. 半月； QT. 七團； SBL. 三伯嶺； SD. 三道； BS. 百色； TY. 田陽； G. 桂； L. 龍； SMJ. 三門江； QS. 區(qū)所； WM. 武鳴。Fig. 1　Dendrogram of materials in this study 　LN. Linong; DY. Duyang; FL. Fulin; HB. Huangbao; ZP. Zuopao; FM. Fengmu; TM. Tiemao; PL. Pingle; RY. Renyong; BY. Banyue; QT. Qituan; SBL. Sanboling; SD. Sandao; BS. Baise; TY. Tianyang; G. Gui; L. Long; SMJ. Sanmenjiang; QS. Qusuo; WM. Wuming.

此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)最大遺傳距離有3對，這可能是由于采用的分子標記區(qū)分度不足所致。為了更好地服務于普通油茶基因組研究和分子標記輔助育種，高質(zhì)量的SSR分子標記亟待大量開發(fā)。

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Genetic diversity analysis of Camellia oleifera in Guangxi using SSR markers

ZHANG En-Hui1, WANG Xiao-Yun1, QIN Zi-Hai2, ZHAO Wen-Dong3,WEI Chang-Jiang3, WANG Peng-Liang2*

( 1. Collaborative Innovation Center for the Modern Technology and Industrial Development of Jiangxi Minority Traditional Medicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine, Nanchang 330004, China; 2.GuangxiKeyLaboratoryofsuperiorTimberTreesResourceCultivation,GuangxiKeyLaboratoryofSpecialNon-woodForestCultivation&Utilization,GuangxiForestryResearchInstitute, Nanning 530002, China; 3.GuangxiState-ownedSanmenjiangForestryFarm, Liuzhou 545006, China )

Oil tea (Camelliaoleifera) is the important oiltree in our country with the vastest area of distribution and the most products in the genus ofCamellia. Guangxi Zhuang Autonomous Region, the important distribution area of oil tea, abounds in oil tea germplasm resources. In order to evaluate genetic variation of germplasm resources of oil tea in Guangxi for germplasm conservation and cultivar selection, 10 SSR primer pairs were screened and evaluated in the present study, then genetic diversity of 97 representive germplasm resources of oil tea in Guangxi was analysed based on the polymorphic SSR markers. The findings indicated as follows: Firstly, of the ten developed SSR primer pairs, seven codominant primer pairs could produced stable amplicons, and another two primers could produce unstable amplicons; the remaining one yielded no band on the gel. Secondly, a total of 33 alleles were detected among 97 oil tea germplasm resources using seven codominant SSRs, and the number of alleles was from three to six with an average of 4.714 3 for every pair of primers; the number of effective allele ranged from 2.084 2 to 4.314 8 with an average of 2.828 8, and the gene diversity was from 0.520 2 to 0.768 2 with an average of 0.628 1. Thirdly, almost loci out of Hardy-Weinberg equilibrium meant genetic structure in the population, the ranges of observed and expected heterozygosity were 0.413 0-0.670 1 and 0.523 3-0.772 4，with the averages of 0.569 8 and 0.631 6. Finally, the range of genetic distances among germplasm resources was 0.05-0.791 7, with an average of 0.354 5. The cluster analysis based on UPGMA method revealed that the germplasm resources from the same places could not cluster in the same branch, on the other hand, the germplasm resources in one branch came from several places. The foregoing results reveavled that the developed SSRs of oil tea were suitable to work in the oil tea in Guangxi and the genetic diversity of germplasm resources in Guangxi was relatively higher. Those findings provide the scientific evidences for deep exploitation and efficient utilization of genetic resources of oil tea in Guangxi.

oil tea (Camelliaoleifera), SSR marker, genetic diversity, genetic structure, multiple alleles

10.11931/guihaia.gxzw201502002

2015-05-02

2015-07-18

國家自然科學基金(31460208)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31460208)]。

張恩慧 (1990-)，女，河南寶豐人，在讀碩士研究生，主要研究方向為藥用植物分子生物學，(E-mail)993587028@qq.com。

王鵬良，博士，高級工程師，研究方向為植物分子育種，(E-mail) pengliang_wang@163.com。

Q949

A

1000-3142(2016)07-0806-06

張恩慧，王曉云，覃子海，等. 廣西普通油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 廣西植物，2016，36(7):806-811

ZHANG EH,WANG XY,QIN ZH，et al. Genetic diversity analysis ofCamelliaoleiferain Guangxi using SSR markers[J]. Guihaia，2016，36(7):806-811