土壤磷酸酶活性測定方法的改進

石春芳, 王志勇, 冷小云, 劉菊梅, 曹菊梅

(1. 內蒙古科技大學 數理與生物工程學院, 內蒙古 包頭　014010；2. 內蒙古大學 生命科學學院, 內蒙古 呼和浩特　010021；3. 內蒙古包頭市土壤肥料工作站, 內蒙古 包頭　014010； 4 內蒙古包頭北郊污水處理廠, 內蒙古 包頭　014010)

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土壤磷酸酶活性測定方法的改進

石春芳1,2, 王志勇3, 冷小云1, 劉菊梅1, 曹菊梅4

(1. 內蒙古科技大學 數理與生物工程學院, 內蒙古 包頭014010；2. 內蒙古大學 生命科學學院, 內蒙古 呼和浩特010021；3. 內蒙古包頭市土壤肥料工作站, 內蒙古 包頭014010； 4 內蒙古包頭北郊污水處理廠, 內蒙古 包頭014010)

磷酸酶是土壤中非常重要的酶類,其活性可作為評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標，快速、簡便、準確的測定方法對磷酸酶的研究具有促進作用。在磷酸苯二鈉比色法基礎上進行改進,用酶標板/酶標儀測定吸光度,不僅減少了試劑使用量,而且縮短了測定時間,在樣品量較大時可降低操作人員的工作強度。

土壤； 磷酸酶活性； 測定方法

土壤酶來源于土壤微生物的生長代謝活動和植物根系分泌物,主要參與土壤中物質的生物轉化和養分形態轉化。通過分析土壤酶活性大小,可以間接考察土壤微生物群落活性、土壤生物化學反應程度、土壤肥力狀況及土壤污染狀況[1-4]。磷酸酶是土壤中一類重要的酶類,參與有機磷的轉化,可加速有機磷的脫磷速度,其活性高低與土壤中有機磷含量和pH值相關,可作為評價土壤磷素生物轉化方向和強度的指標[5-7]。磷酸酶活性的測定,其基本原理是根據酶促作用生成的有機基團量或無機磷量來計算磷酸酶活性[8-9],前一種方法通稱為有機基團含量法,是較為常用的測定磷酸酶活性方法,后一種稱為無機磷含量法。磷酸苯二鈉比色法即是一種采用有機基團含量法測定磷酸酶活性的方法,所用基質為磷酸苯二鈉,利用分光光度計測定A660[10-12]。本實驗的改進之處是縮小顯色液體積,吸光度測定利用酶標儀,在減少試劑用量的同時,縮短了讀數時間,當測定樣本量較大時,可降低操作人員的工作強度。

1　實驗材料與方法

1.1儀器和主要試劑

儀器:酶標儀、酶標板、移液槍、恒溫培養箱。

試劑:硼酸鹽緩沖液，0.5%磷酸苯二鈉，氯代二溴對苯醌亞胺試劑，甲苯，0.3%硫酸鋁溶液，酚標準溶液(0.01mg/mL)。

1.2實驗方法

1.2.1原有方法

實驗步驟:稱5g土樣置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,輕搖15min后加入20mL、0.5%用硼酸鹽緩沖液配制的磷酸苯二鈉,搖勻后放入恒溫箱,37 ℃下培養24h；然后在培養液中加入100mL、0.3%硫酸鋁溶液并過濾；吸取3mL濾液于50mL容量瓶中,然后按繪制標準曲線方法顯色。

標準曲線繪制:取0、1、3、5、7、9、11、13mL酚工作液,置于50mL容量瓶中,每瓶加入5mL硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑,顯色后稀釋至刻度；30min后,在分光光度計上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2改進方法

實驗步驟:稱5g土樣置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,輕搖15min后,加入20mL用硼酸鹽緩沖液配制的0.5%磷酸苯二鈉,搖勻后放入恒溫箱,37 ℃下培養24h；然后在培養液中加入100mL、0.3%硫酸鋁溶液并過濾；吸取0.3mL濾液于10mL試管中,然后按繪制標準曲線方法顯色。

標準曲線繪制:取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL酚工作液,置于10mL試管中,每管加入0.5mL硼酸緩沖液和1滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑,顯色后稀釋至5mL；30min后,吸取200μL加入酶標板,在酶標儀上測定A660。以顯色液中酚濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。

2　結果與討論

2.1標準曲線繪制

用移液槍分別吸取不同體積的酚工作液(0.01g/L)至10mL試管中,分別加入0.5mL硼酸緩沖液,1滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑,顯色后分別加入相應體積的蒸餾水,顯色液總體積為5mL；30min后用移液槍吸取200μL顯色液至于酶標板中,在酶標儀中測定A660。

顯色液體系及標準曲線分別見表1和圖1。

表1　標準曲線繪制時的顯色液體系

圖1　酚標準曲線

由圖1可見,回歸系數為0.9983,線性較好。

2.2兩種方法對比

原方法與改進方法的顯色液用量的比較見表2。

表2　兩種方法顯色液用量的比較

由表2可見,改進方法中顯色液總體積大幅度降低,所需試劑使用量減少到原方法的1/10,可同時測定的樣品數由5個增加到96個,改進方法可大大縮短樣品分析測定時間,減少樣品及試劑使用量。

2.3土壤樣品堿性磷酸酶活性測定結果比較

利用兩種方法測定4個土壤樣品的堿性磷酸酶活性,測定結果見表3。

表3　土壤堿性磷酸酶活性

由表3可見,改進方法測定的土壤堿性磷酸酶活性與原方法測定結果非常接近,t檢驗表明,兩種方法測定結果之間無顯著差異(p=0.348)。

3　結論

(1) 改進后的土壤堿性磷酸酶活性測定方法,可縮短樣品檢測分析時間,減少試劑的使用量。

(2) 利用改進方法繪制的酚標準曲線結果表明線性回歸較好。

(3) 對4個土壤樣品堿性磷酸酶活性測定結果表明,改進方法與原方法無顯著差異,樣品量較大時推薦采用改進方法進行測定。

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Improvementofsoilphosphataseactivitymeasurementmethod

ShiChunfang1,2,WangZhiyong3,LengXiaoyun1,LiuJumei1,CaoJumei4

(1.SchoolofMathematics,PhysicsandBiologicalEngineering;InnerMongoliaUniversityofScience&Technology,Baotou014010,China; 2.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China; 3.SoilandFertilizerStationofBaotou,Baotou014010,China；4.BaotouNorthSuburbWastewaterTreatmentPlant,Baotou014010,China)

Phosphatasewasveryimportantsoilenzymeswhichhasbeeninvolvedintheconversionoforganicphosphorusinthesoil,anditsactivitycouldbevaluedasindicatorofsoilphosphorusbiotransformationdirectionandstrength.Thefast,simpleandaccuratemeasuringmethodhasafacilitatingroleinphosphatasesresearch.ImprovementmethodisbasedonDisodiumphosphatebenzenecolorimetricmethod,andtheabsorbancewasmeasuredbymicrotiterplates/microplate.Notonlytheamountofreagentusehasbeenreduced,butalsothemeasurementtimehasbeenshortened,andtheoperators’workintensitycanbereducedwhentherewerelotsofsamples.

soil；phosphataseactivity；measurementmethod

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.07.012

2015-11-16

包頭市科技計劃項目(2014Z1010-3)；內蒙古自治區自然科學基金項目(2015MS0332)

石春芳(1978—)，女(蒙古族)，內蒙古包頭，碩士，副教授，主要從事環境生物技術方面的科研工作.

E-mail：13848273693@163.com

S151.9

B

1002-4956(2016)7-0048-02