Notch1基因沉默的人絨毛膜上皮癌細胞增殖及侵襲能力變化

劉紹晨，許倩，李健會

(河北承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理教研室，河北承德067000)

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Notch1基因沉默的人絨毛膜上皮癌細胞增殖及侵襲能力變化

劉紹晨，許倩，李健會

(河北承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理教研室，河北承德067000)

目的觀察Notch1基因沉默后人絨毛膜上皮癌細胞增殖及侵襲能力變化。方法查閱GenBank提供的Notch1序列(NM-001105721.1)設計引物，合成Notch1 siRNA。分離培養(yǎng)人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞，分為A、B、C組。A組不做轉染，B組轉染control siRNA，C組轉染Notch1 siRNA。分別于轉染后12、24、36、48、60 h采用MTT法檢測各組細胞增殖能力(OD值)。轉染后48 h采用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。轉染后72 h采用Western blotting法檢測各組細胞中的MMP-2、MMP-9蛋白。結果轉染后36、48、60 h C組OD值低于A、B組(P均<0.05)。A、B、C組穿膜細胞數分別為(109±6)、(118±7)、(59±4)個，C組與A、B相比，P均<0.05。A、B、C組細胞中MMP-2蛋白相對表達量分別為0.91±0.08、0.87±0.01、0.29±0.05，MMP-9蛋白相對表達量分別為0.85±0.04、0.79±0.03、0.35±0.05，C組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量與A、B組相比，P均<0.05。結論Notch1基因沉默后，人絨毛膜上皮癌細胞增殖受到抑制，侵襲能力減弱。

絨毛膜上皮癌；Notch1基因；RNA干擾技術

絨毛膜上皮癌是一種高度惡性的滋養(yǎng)細胞腫瘤，早期即可發(fā)生血行轉移，目前總體療效不滿意，患者5年生存率僅為43%[1,2]。近年來分子靶向治療日益受到關注[3]，其在發(fā)揮更強抗腫瘤活性的同時減小了對正常細胞的毒性作用。Notch信號通路在細胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用，且與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Pang等[4]研究表明，Notch1可增強滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。Cobellis等[5]發(fā)現VEGF表達減少導致Notch蛋白表達下調，影響滋養(yǎng)細胞對子宮內膜的可控性侵襲，與子癇前期發(fā)病有關。Notch信號通路可能參與了絨毛膜癌的發(fā)生。2014年6月～2015年10月，本研究借助RNA干擾(RNAi)技術沉默人絨毛膜上皮癌細胞中Notch1基因表達，并觀察了細胞增殖及侵襲能力變化，現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗細胞與材料人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞系購自中國科學院動物研究所計劃生育與生殖生物學國家重點實驗室，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，DMEM、MTT購自美國Gibco BRL公司，HERAcell 150型CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組JEG-3細胞常規(guī)復蘇后，置于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷丙酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。3次傳代穩(wěn)定后用于實驗。將細胞分為A、B、C組。

1.3Notch1 siRNA序列合成與轉染查閱GenBank提供的Notch1序列(NM-001105721.1)設計引物，由上海吉瑪公司合成。Notch1 siRNA序列為5′-CCGCCTTTGTGCTTCTGTT-3′，control siRNA序列為5′-UUTUCGCAUCGAGUCACGUCT-3′。將處于對數生長期的各組細胞用胰酶消化，按2×105/孔接種于6孔板，加入無雙抗DMED培養(yǎng)基，細胞密度為60%。A、B、C組分別加入Opti-MEM培養(yǎng)基/LipofcctamieTM2000復合物、control siRNA/LipofcctamieTM2000復合物和Notch1 siRNA/LipofcctamieTM2000復合物，培養(yǎng)6 h后換DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，之后消化吸收細胞備用。Western blotting法檢測各組Notch1蛋白，結果顯示C組Notch1蛋白表達水平低于A、B組。

1.4細胞增殖能力檢測分別于轉染后12、24、36、48、60 h測定細胞增殖能力。將各組對數生長期細胞以1×104/孔接種于96孔板內，過夜培養(yǎng)。將各融合蛋白稀釋加入孔中，A組加入NusA，37 ℃培養(yǎng)，各孔加20 μL MTT溶液，室溫反應4 h后棄上清，再加入150 μL DMSO，震蕩10 min，溶解結晶。使用酶標儀測定490 nm波長光密度值(OD值)，代表細胞增殖能力。

1.5細胞侵襲能力檢測包被基底膜，將Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋(比例為1∶8)，取50 μL加入Transwell小室上室，風干。水化基底膜，棄培養(yǎng)板中的殘留液體，加入50 μL無血清培養(yǎng)液。收集轉染48 h后的各組細胞，用含10 g/L 牛血清白蛋白(BSA)的無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，使細胞密度為1×105/mL。接種200 μL細胞懸液到上室中，將小室置于含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的24孔板，孵育24 h，PBS淋洗，擦掉上室內細胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，結晶紫染色，倒置顯微鏡下(200×)隨機選取5個視野，計數穿過小室膜孔的細胞。

1.6細胞中MMP-2及MMP-9蛋白檢測收集轉染72 h后的細胞，采用Western blotting法檢測各組細胞中的MMP-2、MMP-9蛋白，按試劑盒說明書操作。圖像分析軟件分析灰度值，表示蛋白相對表達量。

2　結果

2.1各組細胞增殖能力比較轉染后36、48、60 h C組OD值低于A、B組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組轉染后不同時間OD值比較±s)

注：與A、B組相比，*P<0.05。

2.2各組細胞侵襲能力比較A、B、C組穿膜細胞數分別為(109±6)、(118±7)、(59±4)個，C組與A、B相比，P均<0.05。

2.3各組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達比較A、B、C組細胞中MMP-2蛋白相對表達量分別為0.91±0.08、0.87±0.01、0.29±0.05，MMP-9蛋白相對表達量分別為0.85±0.04、0.79±0.03、0.35±0.05，C組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量與A、B組相比，P均<0.05。

3　討論

滋養(yǎng)層細胞在正常妊娠時呈現類似惡性腫瘤的特性，區(qū)別在于滋養(yǎng)層細胞對子宮內膜組織的侵入受到嚴格調控，當調控出現紊亂時，則可能導致絨毛膜癌的發(fā)生。目前發(fā)現多種細胞因子及信號通路參與絨毛膜癌細胞的轉移侵襲[6～8]。Notch信號通路與腫瘤關系密切，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥形成中均發(fā)揮重要作用。Notch1是腫瘤組織中最常表達的Notch家族成員之一，Notch1參與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9～11]。研究[12～15]表明，Notch1信號通路相關基因突變是急性T淋巴細胞白血病發(fā)生的關鍵誘因。在細胞的增殖、凋亡及分化過程中，也有Notch1信號通路的參與[16～19]。

RNAi技術是通過siRNA介導、在mRNA水平將相應序列基因關閉或沉默的過程，穩(wěn)定性、特異性高，成功率高，近年來被廣泛應用于細胞信號轉導及基因表達研究領域。我們通過siRNA技術沉默JEG-3細胞中Notch1基因表達，結果顯示C組Notch1蛋白表達水平低于A、B組，提示通過RNAi技術沉默Notch1基因表達成功。C組轉染后36、48、60 h細胞增殖能力低于A、B組，轉染后48 h C組穿膜細胞數少于A、B組，提示沉默Notch1基因表達可抑制JEG-3細胞增殖。

一項胰腺癌相關研究結果顯示，上調Notch1基因表達可活化NF-κB信號通路，使MMP-9表達增高，促進腫瘤的浸潤轉移；而應用siRNA技術沉默Notch1基因后，則有抑制腫瘤侵襲的效果。Notch1信號通路可能通過調控MMP-9表達從而調節(jié)胰腺癌細胞的侵襲過程。目前普遍認為，細胞間黏附力降低和基底膜、細胞外基質降解是腫瘤細胞侵襲轉移的重要步驟。MMP不僅可以降解細胞外基質，還可結合并活化腫瘤細胞膜上的跨膜蛋白，從而促進腫瘤細胞侵襲轉移。我們通過Transwell侵襲實驗發(fā)現，C組穿膜細胞數較A、B明顯減少，且細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達下調，提示Notch1沉默后JEG-3細胞侵襲能力減弱，可能是通過下調MMP-2、MMP-9表達實現的。

結合上述研究結果，我們認為，Notch1沉默后人絨毛膜上皮癌細胞增殖受到抑制，細胞侵襲能力減弱，Notch信號通路有望成為人絨毛膜上皮癌新的治療靶點。

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Changes in proliferation and invasive abilities of human chorionic epithelioma cells after silencing Notch1 gene

LIU Shaochen,XU Qian,LI Jianhui

(Pathology and Pathophysiology of Hebei Chengde Medical College,Chengde 067000,China)

ObjectiveTo observe the changes in the proliferation and invasive abilities of human chorionic epithelioma cells after silencing Notch1 gene.MethodsWe looked up Notch1 sequence (NM 001105721.1) design primers provided by Genbank to synthesize Notch1 siRNA.Human chorionic epithelioma cells JEG-3 were cultivated and divided into groups A,B and C.The group B was transfected by control siRNA,group C was transfected by Notch1 siRNA and group A without any transfection.12,24,36,48,60 hours after transfection,the cell proliferation ability was determined by MTT in each group,and the invasion ability was detected by Transwell invasive experiment.The expression of MMP-2 and MMP-9 protein was detected by Western blotting 72 h after transfection.ResultsThe cell proliferation ability of group C at 36 h,48 h and 60 h after transfection was lower than those of groups A and B (all P<0.05).The number of cells penetrating the membrane in the groups A,B and C were 109±6,118±7 and 59±4; significant difference was found between group C and groups A and B (all P<0.05).The relative expression of MMP-2 of groups A,B and C was 0.91±0.08,0.87±0.01 and 0.29±0.05,respectively.The relative expression of MMP-9 of groups A,B and C was 0.85±0.04,0.79±0.03 and 0.35±0.05,respectively.The expression of MMP-2 and MMP-9 in the group C was lower than that of groups A and B (all P<0.05).ConclusionThe cell proliferation of human chorionic epithelioma is inhibited and the invasive ability is decreased after silencing Notch1 gene.

chorionic epithelioma; Notch1 gene; RNA interference

河北省高等學校科學研究計劃項目(QN2014011)；河北省病理學與病理生理學重點學科；河北省人口和計劃生育委員會科技研究計劃項目(ZL20140231)。

劉紹晨(1976-)，男，講師，主要研究方向為腫瘤病理學。E-mail：liusgaochen6666@126.com

劉紹晨

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.004

R737.3

A

1002-266X(2016)19-0012-03

2015-11-30)