RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響

張正娥

(荊州市中心醫(yī)院·華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州434020)

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RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響

張正娥

(荊州市中心醫(yī)院·華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北荊州434020)

目的觀察子宮內(nèi)膜癌組織中人RalA結(jié)合蛋白1(RLIP76)的表達(dá)變化，以及沉默RLIP76基因表達(dá)后對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響。方法①子宮內(nèi)膜癌組織中RLIP76表達(dá)觀察：采用免疫組化法檢測(cè)58例份子宮內(nèi)膜癌組織、40例份子宮內(nèi)膜不典型增生組織和40例份正常子宮組織中的RLIP76，分析RLIP76表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。②RLIP76對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡影響觀察：培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，分為RLIP76抑制組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，RLIP76抑制組轉(zhuǎn)染RLIP76 siRNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA，空白對(duì)照組不做處理、常規(guī)培養(yǎng)；凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中的Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白。結(jié)果子宮內(nèi)膜癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織中RLIP76陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.0%(47/58)、52.5%(21/40)、22.5%(9/40)，RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織(P均<0.05)。RLIP76表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。RLIP76抑制組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為33.72%±3.25%、14.14%±3.19%、13.98%±2.97%，RLIP76抑制組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論RLIP76蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)；沉默RLIP76基因表達(dá)后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡增多，推測(cè)RLIP76可能通過上調(diào)凋亡抑制因子表達(dá)、抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。

子宮內(nèi)膜癌；人RalA結(jié)合蛋白1；基因沉默；細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn)，患者預(yù)后較差[1]。人RalA結(jié)合蛋白1(RLIP76)是Ras超家族成員，定位于人18號(hào)染色體p11.3，可作為膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)體水平，亦可與Ral、Hsf-1等結(jié)合而活化相應(yīng)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡[2]。有研究[3]指出，RLIP76與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，下調(diào)RLIP76表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[4]。本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌組織中RLIP76的表達(dá)變化，并利用RNA干擾技術(shù)沉默RLIP76，探討其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡中的作用，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞2011年2月～2014年3月手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本58例份，患者年齡28～72(48.5±9.3)歲，病理分級(jí)Ⅰ級(jí)38例、Ⅱ級(jí)12例、Ⅲ級(jí)8例，F(xiàn)IGO分期Ⅰ期46例、Ⅱ期8例、Ⅲ期3例、Ⅳ期1例，患者術(shù)前均未行放化療治療。選擇同期手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜不典型增生標(biāo)本40例份和正常子宮組織標(biāo)本40例份。所有留取組織標(biāo)本均保存于-70 ℃冰箱備檢。人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株由上海美軒生物科技有限公司提供，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清)，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2子宮內(nèi)膜癌組織中RLIP76表達(dá)觀察取組織標(biāo)本石蠟固定后切片，常規(guī)脫蠟水化，高溫高壓下抗原修復(fù)，用3% H2O2室溫下處理15 min，加入封閉液。加入兔抗人RLIP76單克隆抗體(購(gòu)自上海麥倉(cāng)生物科技有限公司)，室溫孵育60 min。DAB顯色，中性樹脂封片，用兔抗IgG替代一抗作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察。結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度判定結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞百分比為0計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，>10%～25%計(jì)2分，>25%～50%計(jì)3分，>50%計(jì)4分；細(xì)胞質(zhì)無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；兩項(xiàng)評(píng)分之和≤2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.3RLIP76對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡影響觀察

1.3.1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞分組及RLIP76 siRNA轉(zhuǎn)染RLIP76 siRNA和陰性對(duì)照siRNA序列由上海生工公司設(shè)計(jì)，序列分別為5′-GACUCCAGUGGUAAUCUACTT-3′、5′-GUAGAUUACCACUGGAGUCTT-3′,分別合成重組質(zhì)粒pRNAT-RLIP76、pRNAT-neg。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞按5×105/mL接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pRNAT-RLIP76(RLIP76抑制組)和pRNAT-neg(陰性對(duì)照組)，以不做處理、常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。將細(xì)胞板置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)，每5 h更換1次培養(yǎng)基。采用real-time PCR法檢測(cè)RLIP76 mRNA，RLIP76抑制組細(xì)胞中RLIP76 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，說明RLIP76 siRNA轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2凋亡細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入胰酶消化、離心，取1×106/mL細(xì)胞重懸于緩沖液中，取100 μL細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，搖勻后室溫下暗室培養(yǎng)20 min，取出即刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.3.3細(xì)胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后取各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解后提取總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。取50 μg蛋白行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉60 min，分別將不同一抗[兔抗人Survivin單克隆抗體(1∶200)、兔抗Caspase-3單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗Caspase-9單克隆抗體(1∶500)]加入，4 ℃過夜孵育，加入二抗，37 ℃下反應(yīng)120 min，ECL試劑盒顯色，用雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)分析,獲得目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌組織中RLIP76表達(dá)及其與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系子宮內(nèi)膜癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織中RLIP76陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.0%(47/58)、52.5%(21/40)、22.5%(9/40)，RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織(P均<0.05)。RLIP76表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.2各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡情況RLIP76抑制組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為33.72%±3.25%、14.14%±3.19%、13.98%±2.97%，RLIP76抑制組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。詳見圖1。

表1　RLIP76表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，*P<0.05。

注：A為RLIP76抑制組，B為陰性對(duì)照組，C為空白對(duì)照組。

圖1各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡情況

2.3各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)比較RLIP76抑制組Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2　各組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)比較

注：與RLIP76抑制組相比，*P<0.05。

3　討論

近年來，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率不斷升高且呈低齡化趨勢(shì)[5]，雖然診療手段得到進(jìn)步和發(fā)展，但患者5年生存率仍處于較低水平[6]。研究[7]表明，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差的主要原因。RLIP76是Ral結(jié)合蛋白，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、分裂和凋亡中發(fā)揮重要作用，主要表達(dá)于乳腺、心臟、肝臟和紅細(xì)胞中，在腦組織及結(jié)腸組織中表達(dá)較少[8]。RLIP76在腫瘤組織中表達(dá)異常增高，是PI3K/Akt、Racl-JNK等多種信號(hào)通路的關(guān)鍵性調(diào)控因子，而這些信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移中發(fā)揮重要作用[9]。研究[10,11]表明，RLIP76在卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)。潘海霞等[12]抑制小細(xì)胞肺癌H69細(xì)胞株中RLIP76表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性增強(qiáng)，認(rèn)為RLIP76可能參與了小細(xì)胞肺癌多藥耐藥的產(chǎn)生，可作為小細(xì)胞肺癌化療敏感性和臨床預(yù)后的參考指標(biāo)。

本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌組織中RLIP76的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織，且RLIP76表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示RLIP76的異常表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病和侵襲。推測(cè)機(jī)制：RLIP76作為GTP酶激活蛋白家族成員，在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生及細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，RLIP76過表達(dá)可能通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、分裂和凋亡而參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病。

為進(jìn)一步探討RLIP76在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們利用RNA干擾技術(shù)沉默Ishikawa細(xì)胞株中RLIP76基因表達(dá)，然后發(fā)現(xiàn)，RLIP76抑制組細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明特異性沉默RLIP76基因可促使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。Survivin是一種凋亡抑制因子，能夠抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)[13]；Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族重要成員，在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，與凋亡蛋白酶活化因子結(jié)合，使Caspase-9前體活化[14]，進(jìn)一步使Caspase-3蛋白前體活化，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[15,16]。本研究結(jié)果顯示，RLIP76抑制組Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，提示RLIP76可能通過上調(diào)凋亡抑制因子表達(dá)、抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞躲避凋亡程序，實(shí)現(xiàn)異常增殖。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，RLIP76在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；沉默RLIP76基因表達(dá)后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡增多，推測(cè)RLIP76可能通過上調(diào)凋亡抑制因子表達(dá)、抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。

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