子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中Twist蛋白、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白表達變化

朱翔翡，陸曉媛，王靜

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫學院附屬醫院)

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子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中Twist蛋白、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白表達變化

朱翔翡1，陸曉媛2，王靜2

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫學院附屬醫院)

目的觀察子宮內膜異位癥患者異位子宮內膜組織中Twist蛋白、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達變化，探討三者與子宮內膜異位癥的關系。方法采用免疫組化SP法檢測30例子宮內膜異位癥患者在位內膜組織(在位內膜組)、異位內膜組織(異位內膜組)及30例非子宮內膜異位癥患者的正常內膜組織(正常對照組)中的Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin，計算各組蛋白高表達(強陽性表達)率；分析異位內膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達的相關性。結果異位內膜組、在位內膜組、正常對照組中Twist蛋白高表達率分別為70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表達率分別為6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表達率分別為66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表達率在異位內膜組、在位內膜組、正常對照組依次升高，E-cadherin高表達率依次減小(P均<0.05)。異位內膜組織中Twist蛋白表達與E-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.463，P<0.01)，與N-cadherin表達呈正相關關系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表達與N-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.502，P<0.01)。結論子宮內膜異位癥患者的異位子宮內膜組織中Twist蛋白和N-cadherin表達上調，E-cadherin表達下調，三者相互作用，共同參與了子宮內膜異位癥的發生發展。

子宮內膜異位癥；異位子宮內膜;Twist蛋白；E-鈣黏蛋白；N-鈣黏蛋白；上皮間質轉化

子宮內膜異位癥(EMs)是婦科常見病、多發病，也是具有轉移及復發特點的良性疾病，其發病原因目前尚不明確。近年來研究者[1]提出“在位內膜決定論”，即異位子宮內膜的種植、生長與子宮內膜的增殖、侵襲、轉移等能力密不可分。子宮內膜的轉移能力可能與上皮間質轉化(EMT)有關[2，3]。上皮間質轉化因子Twist基因、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)是EMT過程中的重要因子[4，5]，在乳腺癌、膀胱癌等惡性疾病中研究較多，但對于三者在子宮內膜異位癥中的表達少有報道。為此，本研究觀察了子宮內膜異位癥患者異位子宮內膜組織中Twist蛋白、E-cadherin及N-cadherin的表達變化，分析三者與子宮內膜異位癥發生發展的關系。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年9月～2015年7月在徐州醫學院附屬醫院行腹腔鏡下盆腔子宮內膜異位病灶清除術的子宮內膜異位癥患者30例，年齡24～52歲，術中留取異位內膜組織(異位內膜組)和在位內膜組織(在位內膜組)各30例份。隨機選取行診斷性刮宮治療的非子宮內膜異位癥患者30例，年齡28～51歲，術中留取正常增生期子宮內膜組織30例份(正常對照組)。納入研究的所有患者均未合并其他子宮內膜病變，術前6個月內未行性激素類藥物或其他藥物治療，未放置宮內節育器，無妊娠及哺乳、刮宮史，無內分泌疾病及免疫疾病。子宮內膜異位癥患者與非子宮內膜異位癥患者的年齡、孕次和月經周期資料具有可比性。見表1。

表1　納入患者年齡、孕次、月經周期比較±s)

1.2主要試劑及儀器兔抗人多克隆抗體Twist購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人多克隆抗體E-cadherin購自美國Proteintech Group公司(由徐州博立達生物科技有限公司代購)，兔抗人多克隆抗體N-cadherin購自美國Proteintech Group公司(由徐州博立達生物科技有限公司代購)，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自徐州博立達生物科技有限公司。

1.3Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin檢測采用免疫組化SP法。具體步驟如下：石蠟常規包埋組織，4 μm連續切片；切片脫蠟，水化；高壓修復5 min(出蒸汽后計算)，使用枸櫞酸修復液；3%過氧化氫封閉30 min；PBS清洗后滴加一抗，4 ℃過夜；滴加生物素標記的二抗，室溫30 min；滴加SP，室溫30 min；DAB顯色；蘇木精復染。首先在低倍鏡下閱片，再在高倍鏡下選取5個視野進行計數，計數不少于100個細胞，以細胞中出現棕褐色、棕黃色或淡黃色顆粒為蛋白表達陽性[6，7]；Twist、N-cadherin主要定位于細胞質，細胞膜也有少量表達；E-cadherin主要定位于細胞膜，少數在細胞質有表達。根據染色強度與陽性細胞百分比判定結果：染色強度為無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞百分比≤5%計0分，>5%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%計3分；兩項積分相加，0、1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3、4分為陽性(++)，5、6分為強陽性(+++)，統計強陽性表達(高表達)例數。

1.4統計學方法采用SPSS16.0軟件進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組子宮內膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達比較異位內膜組、在位內膜組、正常對照組中Twist蛋白高表達率分別為70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表達率分別為6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表達率分別為66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表達率在異位內膜組、在位內膜組、正常對照組依次升高，E-cadherin高表達率依次減小(P均<0.05)。詳見表2。

表2　不同子宮內膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與在位內膜組相比，#P<0.05。

2.2異位內膜組織中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表達相關性分析異位內膜組織中Twist蛋白表達與E-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.463，P<0.01)，與N-cadherin表達呈正相關關系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表達與N-cadherin表達呈負相關關系(r=-0.502，P<0.01)。

3　討論

EMT存在于在胚胎發育、組織重建、慢性炎癥等過程中，EMT伴隨上皮細胞極性消失、細胞骨架重塑、細胞間黏附力減弱及細胞遷移能力增強[8，9]。近年研究發現，EMT與腫瘤轉移及多種纖維化疾病的發病有關。鈣黏蛋白在EMT過程中發揮重要作用。上皮細胞間連接需要E-cadherin，其高表達可抑制細胞遷移，使細胞保持完整、緊密連接，并完成機體相關指令；而在多種因素影響下，如腫瘤基因突變、基因異常轉錄后修飾(磷酸化或糖基化)、蛋白水解增強等均可導致E-cadherin表達下調或缺失，減弱細胞黏附能力，細胞極性發生改變、運動能力增強，容易發生侵襲和轉移[10]。多數腫瘤組織中E-cadherin表達受抑，導致細胞表型改變，間充質細胞中N-cadherin表達增高，腫瘤細胞侵襲轉移能力增強[11，12]，因此，E-cadherin表達降低提示EMT的發生[13]。本研究中，異位內膜組E-cadherin高表達率低于在位內膜組和正常對照組，而N-cadherin表達趨勢與之相反，印證了子宮內膜異位癥的轉移及侵襲性與EMT有關。

Twist基因是參與EMT過程的一種凋亡抑制因子，多項研究顯示其能夠獨立抑制E-cadherin表達同時上調纖連蛋白和N-cadherin表達。人Twist蛋白通過分子中的堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)可特異性結合DNA上的E-box序列(CANNTG)[14]形成同源或異源二聚體，調節靶基因轉錄。國內外研究[15，16]表明，Twist作為上皮間質轉錄因子，與惡性腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移均有密切關系。

本研究中，E-cadherin在正常對照組、在位內膜組、異位內膜組表達依次降低，N-cadherin表達依次增高，且E-cadherin與N-cadherin表達呈負相關關系、提示E-cadherin表達降低、N-cadherin表達上調是EMT發生的標志，子宮內膜異位癥發生發展過程中伴隨著EMT。而Twist蛋白在異位內膜組織中高表達，且Twist蛋白與E-cadherin表達呈負相關關系、與N-cadherin表達呈正相關關系，同樣說明Twist蛋白表達上調與EMT關系密切。推測Twist蛋白過度表達抑制了E-cadherin的正常表達，細胞極性減弱，N-cadherin表達上調，最終導致細胞遷移能力增強。Twist蛋白可能通過誘發EMT從而促進子宮內膜異位癥的發生發展。

綜上所述，Twist蛋白高表達、E-cadherin低表達、N-cadherin高表達使得患者子宮內膜細胞容易從原位脫離，侵襲力增強。Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin在異位子宮內膜組織中的表達變化印證了EMT貫穿子宮內膜異位癥的各個環節。基于上述實驗結果，我們設想Twist、E-cadherin、N-cadherin有望成為子宮內膜異位癥早期診斷的標志物及基因治療的靶點，聯合檢測三種蛋白有望為子宮內膜異位癥的預防、治療、預后評估提供參考。

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陸曉媛(E-mail: 378158854@qq.com)

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1002-266X(2016)19-0062-03

2015-12-08)