對黏蟲具有殺蟲活性的Bt蛋白篩選及分析

楊素娟,　黃閩忠,　李艷秋,　周子珊, 江幸福,　高繼國,　程云霞,　張　杰*

(1. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱　150030; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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對黏蟲具有殺蟲活性的Bt蛋白篩選及分析

楊素娟1,2,黃閩忠1,2,李艷秋1,2,周子珊2, 江幸福2,高繼國1,程云霞2,張杰2*

(1. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱150030; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

為篩選對黏蟲[Mythimnaseparata(Walker) ]具有毒殺作用的蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白,本研究提取Cry1類、Cry2類、Cry9類及Vip3A類等11種蛋白,通過人工飼料喂毒方法對黏蟲進行生物活性測定。結果表明,Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白對黏蟲具有殺蟲活性,其致死中濃度依次為5.09、17.71、26.75、27.42及43.93 μg/g;Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白對黏蟲生長具有抑制作用,其濃度為10 μg/g時的體重抑制率分別為78.4%、79.0%、86.9%,濃度為100 μg/g時的體重抑制率分別為92.8%、95.7%、96.7%;Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白對黏蟲無顯著活性。本研究為黏蟲的生物防治奠定了基礎,并為抗蟲轉基因作物的研究提供優良的候選基因。

蘇云金芽胞桿菌;Cry蛋白;黏蟲;殺蟲活性;生長抑制

黏蟲[Mythimnaseparata(Walker) ]屬于鱗翅目夜蛾科,是一種典型的遠距離遷飛害蟲,主要為害玉米、小麥和水稻等禾谷類糧食作物以及棉花、豆類、蔬菜等上百種植物,嚴重時造成作物減產甚至絕收[1],在亞洲和澳洲經常暴發成災[2]。在我國,除新疆以外,全國各地均有發生。近年來,黏蟲在我國的發生為害呈嚴重趨勢,2012-2013年全國黏蟲連續暴發,其發生面積之大、蟲口密度之高、損失之重,均屬歷史罕見,嚴重威脅我國糧食生產安全[3]。黏蟲的化學防治已經產生了諸多負面影響,如黏蟲抗藥性增強、環境污染、農產品質量安全隱患等嚴重后果,為實現黏蟲的綜合治理,亟須開辟生物防治等綠色防控途徑。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)產生的晶體蛋白(Bt蛋白)是主要的殺蟲成分,對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種害蟲,以及一些線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性[4]。

Bt蛋白針對不同夜蛾科昆蟲的活性,國外已有不少研究報道。Cry1C、Cry1F對甜菜夜蛾[Spodopteraexempta(Walker) ]具有高毒力,而Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1B、Cry1D對其有生長抑制作用[5]。Cry1Ab、Cry1Bb、Cry1Fa、Cry2Aa、Cry1Ia和Vip3Aa對草地貪夜蛾[Spodopterafrugiperda(Smith) ]具有毒殺作用[69]。在國內,相對于Bt對棉鈴蟲和玉米螟的殺蟲作用研究,Bt蛋白對黏蟲殺蟲活性研究相對滯后,關注較少。僅有少數報道發現Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac蛋白對黏蟲具有殺蟲活性[1012]。

針對黏蟲為害加重的現狀,本文以本實驗室11種Bt殺蟲蛋白為基礎,通過測定其LC50、體重抑制率從而獲得對黏蟲有活性的蛋白,再對這些蛋白進行序列分析比較研究,系統篩選對黏蟲具有較高活性的殺蟲蛋白。研究結果可為黏蟲的生物防治提供菌株和蛋白資源,為我國抗蟲轉基因作物的研究提供優良的候選基因。

1　材料和方法

1.1菌株和培養基

供試菌株和質粒見表1。

表1　菌株與質粒

1/2 LB液體培養基:0.5% 胰蛋白胨、0.25% 酵母抽提物、0.5% NaCl,pH 7.0,121℃,滅菌20 min;LB液體培養基:1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母抽提物、1.0% NaCl,121℃,滅菌20 min。

1.2主要試劑和儀器

TaqDNA聚合酶購自康潤生物技術公司;限制性內切酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;質粒提取、DNA回收和PCR產物純化試劑盒購自Axygen公司,其他生化和化學試劑均為市售。

D250搖床,美國NBS公司;Avanti J-26XP高速冷凍離心機,美國Beckman Coulter公司;Mini Protein Ⅲ蛋白電泳儀,美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統,GE公司;CP750超聲波破碎儀,寧波新芝生物公司。

1.3供試昆蟲及人工飼料

黏蟲(M.separata)及人工飼料,由中國農業科學院植物保護研究所遷飛害蟲組提供。

1.4cry1Be4表達載體構建

1.5大腸桿菌Cry及Vip蛋白表達量的測定

Cry1Ba3、Cry1Bb2、Cry1Be4、Cry9Aa3、Cry9Eb1、Cry9Ee1和Vip3Aa11蛋白均于大腸桿菌中進行表達,大腸桿菌的培養采用LB培養基,蛋白的提取采用破碎離心法,具體見Shu等的方法[14]。大腸桿菌中表達的蛋白包括可溶組分和不可溶組分,不可溶組分是由于蛋白在表達的過程中不完全正確折疊所導致的,其在生測過程中所表現的活性較低。為了得到較好的生測結果,需要探索獲得可溶組分含量相對較高的表達條件,為生物活性測定提供足夠的可溶蛋白。本研究設定了18℃和30℃兩個誘導溫度,以及0.1、0.5、1.0 mmol/L 3個IPTG終濃度,對大腸桿菌中表達的蛋白進行表達條件的優化。

殺蟲晶體蛋白的SDS-PAGE分析:吸取蛋白樣品進行制樣,100℃煮沸5 min,13 000 g離心5 min,取上清液點樣于4%濃縮膠,8%分離膠,80 V電泳20 min,150 V電泳直到膠底邊緣。電泳結束后取出凝膠,進行脫色、染色及掃描圖譜,具體方法詳見文獻[15]。使用National Institutes of Health開發的ImageJ 1.44 軟件,分析電泳后的蛋白條帶圖譜并定量,具體使用方法參看ImageJ User Guide 1.44。

1.6蘇云金芽胞桿菌Cry蛋白表達量的測定提取

Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca及Cry2Ab蛋白均于蘇云金芽胞桿菌中進行表達,蘇云金芽胞桿菌的培養采用1/2 LB液體培養基,蛋白的提取采取重復溶解的方法[16]進行,蛋白質的定量分析同1.5小節。

1.7Cry蛋白和Vip蛋白對黏蟲的室內生物活性測定

參考蔣善軍等的方法[11],生測法使用含有Bt蛋白的人工飼料飼喂黏蟲初孵幼蟲,7 d后統計死亡率。具體如下:稱取30 g人工飼料放置于滅菌的培養皿中;加入待測樣品溶液3 mL(初篩均使用10 μg/g和100 μg/g兩個濃度,使用24孔培養板法進行,復篩依據初篩的校正死亡率設定濃度,使用改良的培養皿法進行),充分攪拌,混勻后平均分裝于3個培養皿中;根據飼料的干濕程度室溫放置一段時間,直到飼料表面沒有水滴。每皿接入30頭初孵幼蟲,每個濃度重復3次,共處理90頭試蟲(試蟲接完后于培養皿蓋內墊三層衛生紙,蓋緊培養皿,用橡皮筋扎緊,以防試蟲逃逸);將樣品置于25℃光照培養箱中培養,L∥D=16 h∥8 h,濕度70%～80%,每天觀察飼料干濕程度,適當做出微調(培養箱濕度太低則向里加水,太高則進行干燥處理);培養7 d后調查死蟲和活蟲數并稱重,計算死亡率、校正死亡率(由于大腸桿菌中表達的蛋白使用20 mmol/L Tris-HCl溶解,而蘇云金芽胞桿菌中表達的蛋白使用50 mmol/L Na2CO3溶解,因此生測時分別設置對照,校正死亡率也分別計算)。生測數據采用SPSS 13.0計算致死中濃度(LC50)[17],死亡率、校正死亡率及體重抑制率。

死亡率(%)=死蟲數/(死蟲數+活蟲數)×100;

校正死亡率(%)=[(對照存活率-處理組存活率)/

對照存活率]×100;

體重抑制率(%)=[1-(處理組平均體重/

對照組平均體重)]×100。

2　結果和分析

2.1大腸桿菌中Cry及Vip蛋白的表達

通過反復摸索獲得了本文大腸桿菌蛋白表達的適合條件:Cry1Bb在18℃,IPTG終濃度1.0 mmol/L的條件下進行表達;Cry1Be在30℃,IPTG終濃度為0.1 mmol/L時進行表達;Cry9Ee在30℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L時進行表達;Cry1Ba、Cry9Aa、Cry9Eb和Vip3Aa蛋白均在18℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L時進行表達。提取后對以上蛋白進行SDS-PAGE分析(圖1),箭頭所指條帶為目的蛋白,從左到右依次為Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Be、Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee及Vip3Aa的可溶組分SDS-PAGE結果,其分子量大小依次為137、137、136、129、130、130、89 ku。

圖1　大腸桿菌中表達的Cry及Vip蛋白可溶組分SDS-PAGE分析結果Fig.1　Analysis of soluble Cry and Vip proteins expressed in E. coli by SDS-PAGE

2.2蘇云金芽胞桿菌中表達的Cry蛋白提取

對Bt中表達的Cry蛋白進行SDS-PAGE分析(圖2),箭頭所指條帶為目的蛋白,從左到右依次為Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca及Cry2Ab,其分子量大小依次為130、133、135、65 ku。

圖2　蘇云金芽胞桿菌中表達的Cry蛋白SDS-PAGE分析Fig.2　Analysis of Cry proteins in Bacillus thuringiensis by SDS-PAGE

2.3Cry1、Cry2及Vip蛋白對黏蟲生物活性初次測定結果

Cry1、Cry2及Vip蛋白對黏蟲生物活性測定結果(表2)表明,共有5種對黏蟲殺蟲活性較高的蛋白,按濃度為100 μg/g時的校正死亡率從高到低依次是Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Bb、及Cry1Be,而Cry1Ba、Cry1Ca及Vip3Aa對其無顯著活性,試蟲生長發育仍然正常,大小與對照相似。Cry9類蛋白生測時,試蟲未能正常生長發育,大小基本與接蟲時一樣。

表2　Bt蛋白對黏蟲生物活性初次測定結果1)

1) 生測所用Na2CO3為50 mmol/L,pH 9.6,Tris-HCl為20 mmol/L,pH 8.0。

Na2CO3used for bioassay at 50 mmol/L, pH 9.6; Tris-HCl at 20 mmol/L, pH 8.0.

2.4Cry1及Cry2蛋白對黏蟲的LC50測定結果

對初篩獲得的5種有活性的蛋白進行了復篩(表3),并使用SPSS軟件計算出了5種蛋白的致死中濃度。Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb的LC50依次為5.09、17.71、26.75、27.42 μg/g和43.93 μg/g。

2.5Cry9蛋白對黏蟲生物活性測定結果

由于前期發現Cry9類蛋白可導致黏蟲無法正常生長發育,因此后續對Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee 3個蛋白進行了復篩(表4)。以20 mmol/L的Tris-HCl為陰性對照,設定了10 μg/g和100 μg/g 2個濃度,統計了初孵幼蟲取食7 d的體重變化情況,并計算出了其生長抑制率。結果發現,當濃度為10 μg/g時以上3種蛋白對黏蟲的體重抑制率均在75%以上;100 μg/g時,其體重抑制率均在90%以上,并且Cry9Ee活性最好,其次是Cry9Eb和Cry9Aa。

表3　Cry1、Cry2蛋白對黏蟲的生測結果

表4　Cry9蛋白對黏蟲的體重抑制率1)

1) 生測所用Tris-HCl濃度為20 mmol/L,pH為8.0。

Tris-HCl used for bioassay at the concentration of 20 mmol/L (pH 8.0).

3　討論

本研究提取了對鱗翅目具有殺蟲活性的11種Bt蛋白,對鱗翅目夜蛾科的黏蟲進行生物活性測定,結果顯示Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Bb、Cry1Be和Cry2Ab蛋白對黏蟲具有較好的殺蟲活性,Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白對黏蟲僅具有生長抑制作用,而Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa11蛋白對黏蟲無顯著毒殺作用。

目前國內關于Bt蛋白對黏蟲殺蟲活性的研究很少,2010年蔣善軍利用Cry1Ab、Cry1Ac蛋白飼喂黏蟲,獲得了Cry1Ac蛋白對黏蟲初孵幼蟲處理18 d的LC50為11.23 μg/g,本研究發現了多種對黏蟲具有殺蟲活性的蛋白,并且獲得了其致死中濃度LC50,其中Cry1Bb和Cry1Be對黏蟲具有較好的毒殺作用,3種Cry9蛋白對黏蟲具有顯著的體重抑制作用。已有報道顯示Cry1B、Cry9A蛋白與Cry1A蛋白無交互抗性[18],因此這些蛋白新的活性的發現,有望用于害蟲對Cry1A產品抗藥性治理,并為抗蟲轉基因作物的研發提供新的基因來源。

為了分析Cry1Ba與Cry1Bb、Cry1Be對黏蟲的活性差異,我們從其蛋白質的氨基酸序列出發,以SWISS-MODEL軟件預測了Cry1Ba與Cry1Bb、Cry1Be蛋白的三維結構,并使用DNAMAN軟件,比較了各結構域的相似性以便于初步分析其殺蟲特異性的分子機制。通過比對發現:Cry1Bb和Cry1Be的DomainⅡ氨基酸序列相似度很高,同時兩者與Cry1Ba的DomainⅡ的相似度較低,且三者的Domain I氨基酸序列相似度很高,相似度為91.02%,而三者Domain Ⅲ的氨基酸序列相似度都很低(表5)。

表5　Cry1Bb、Cry1Be和Cry1Ba的結構比較

近年來大量的研究表明,Cry蛋白上某些氨基酸位點或區域與殺蟲特異性有關,由于DomainⅡ是Cry毒素中變化最多的區域[20],該區域被認為是與Cry毒素作用的特異性有關,同時DomainⅡ上暴露在外面的Loop區域與特異的幼蟲中腸蛋白結合有關[2122],與殺蟲特異性有著密不可分的關系。因此,本文以PyMOL軟件分析了Cry1Bb、Cry1Be和Cry1Ba蛋白Domain Ⅱ上的Loop 1、Loop 2、Loop 3的氨基酸序列。結果顯示:三者Loop 1上的氨基酸序列相似度較高,而Cry1Bb、Cry1Be 的Loop 1、Loop 2、Loop 3氨基酸序列相似度均較高,但兩者與Cry1Ba的Loop2、Loop3氨基酸序列差異非常大(表6)。但也有研究發現:Cry4Aa蛋白對尖音庫蚊(Culexpipiens)的活性相關區域不是Domain Ⅱ的Loops,可能是Domain Ⅲ的某個位點[23]。

表6　Cry1Bb、Cry1Be和Cry1Ba的Domain Ⅱ上Loop區域氨基酸組成比較1)

1) 表中粗體部分為差異氨基酸。

The amino acid sequence of the table for the differences in gray.

綜上所述,Cry1Ba的Loop2、Loop3區域氨基酸序列與Cry1Bb、Cry1Be具有非常大的差異,可能是導致其活性差異的關鍵因素。進而我們推測Cry1Bb、Cry1Be與黏蟲中腸刷狀緣膜囊泡BBMV上的受體可以結合,而Cry1Ba無法與之結合。關于其殺蟲機理還需進一步深入的研究。

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(責任編輯：田喆)

Screening and analysis of insecticidal activity of protein fromBacillusthuringiensisagainstMythimnaseparata

Yang Sujuan1,2,Huang Minzhong1,2,Li Yanqiu1,2,Zhou Zishan2, Jiang Xingfu2,Gao Jiguo1,Cheng Yunxia2,Zhang Jie2

(1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin150030, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

In order to investigate the insecticidal activity of someBacillusthuringiensisproteins againstMythimnaseparata(Walker), 11 proteins of Cry1, Cry2, Cry9 and Vip3A were extracted and used for bioassay againstM.separataby feeding artificial diet. The bioassay results showed that Cry1Ac, Cry1Ab, Cry2Ab, Cry1Be and Cry1Bb had insecticidal activity againstM.separatalarvae, with a LC50value of 5.09 μg/g, 17.71 μg/g, 26.75 μg/g, 27.42 μg/g and 43.93 μg/g, respectively. Cry9Aa, Cry9Eb and Cry9Ee only inhibited growth ofM.separata, with a growth inhibition rate of 78.4%, 79.0% and 86.9% at the concentration of 10 μg/g, and with an inhibition rate of 92.8%, 95.7% and 96.7%, respectively, at the concentration of 100 μg/g. However, Cry1Ba, Cry1Ca and Vip3Aa showed no apparent toxicity toM.separatalarvae. It lays the foundation for biological control ofM.separata, and may provide some excellent candidate genes for insect-resistant genetically modified crops.

Bacillusthuringiensis;Cry protein;Mythimnaseparata;insecticidal activity;growth inhibition

20150325

20150414

轉基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08004-009)；公益性行業(農業)科研專項(201403031)

E-mail:jzhang@ippcaas.cn

S 476.11

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.005