對綠盲蝽具有殺蟲活性Bt菌株的篩選及Cry15Aa蛋白活性的研究

張學雯,　束長龍,　陸宴輝,　劉春穎,　張　杰,　高繼國

(1. 東北農業大學生命科學院, 哈爾濱　150030; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害 生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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對綠盲蝽具有殺蟲活性Bt菌株的篩選及Cry15Aa蛋白活性的研究

張學雯1,2,束長龍2*,陸宴輝2,劉春穎2,張杰1,2,高繼國1*

(1. 東北農業大學生命科學院, 哈爾濱150030; 2. 中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害 生物學國家重點實驗室, 北京100193)

Bt棉有效控制了棉田主要害蟲棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，然而原來處于次要地位的刺吸式口器害蟲盲蝽(Heteroptera:Miridae)為害逐年加重，目前對綠盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)有效的抗蟲基因未見報道。本研究以本實驗室保存的Bt殺蟲基因和菌株為材料，對綠盲蝽進行殺蟲活性篩選。利用本實驗室先前克隆的Mtx類殺蟲基因cry15Aa表達產物進行綠盲蝽殺蟲活性測定，研究結果顯示Cry15Aa蛋白對綠盲蝽具有一定的殺蟲活性。通過殺蟲活性測定，獲得對綠盲蝽有效的Bt菌株20株;對這些菌株表達蛋白進行質譜鑒定，LC-MS/MS質譜鑒定結果顯示，這些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余種對鱗翅目、鞘翅目害蟲有殺蟲活性的蛋白片段，并且有4株Bt菌株樣品中檢出了Mtx類殺蟲蛋白Cry15Aa的片段。但是進一步基因鑒定結果表明，這4株菌株并不含有cry15Aa全長基因，推測這些菌株中含有Cry15類的新基因。上述研究結果表明這些菌株中可能存在對盲蝽有效的新型殺蟲蛋白。本研究在發現了cry15Aa基因所表達的蛋白對綠盲蝽具有殺蟲活性的同時，獲得了對綠盲蝽具有殺蟲活性的Bt新菌株，對綠盲蝽的生物防治具有重要的意義。

蘇云金芽胞桿菌;綠盲蝽;殺蟲活性;二級質譜鑒定;Cry15Aa蛋白

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)含有的殺蟲基因已被廣泛應用于轉基因抗蟲作物中[1]。轉基因棉花自1996年商業化種植以來,全球種植面積持續增加,有效地控制了棉花害蟲的為害,減少了化學殺蟲劑的使用[23]。我國于1998年開始商業化種植轉基因棉花,僅2014年就種植了390萬hm2的轉基因棉花,占棉花總種植面積的93%[4]。

目前種植的轉基因棉花品種只對鱗翅目害蟲具有較好的防治效果,例如:棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)和棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)[5]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)等[68];而對半翅目的盲蝽(Heteroptera:Miridae)等刺吸式害蟲沒有防效。由于轉基因棉田的化學農藥使用減少,減弱了對盲蝽等非靶標害蟲的控制[9],使之從次要害蟲逐漸成為Bt棉田的主要害蟲,并且呈現逐漸加重的趨勢[10]。蘇云金芽胞桿菌Mtx殺蟲蛋白是一類與球形芽胞桿菌(Bacillussphaericus)殺蚊蛋白同源的殺蟲蛋白,包括Cry15、Cry23、Cry33、Cry38、Cry45、Cry51、Cry60、Cry64等[11]。其中,Monsanto公司發現的Mtx類殺蟲蛋白TIC807(Cry51Aa2)對豆莢草盲蝽[Lygushesperus(Knight)]和美國牧草盲蝽[Lyguslineolaris(Palisot de Beauvois)]具有較好的殺蟲活性[12]。在我國,棉田主要為害的盲蝽有綠盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)、牧草盲蝽[Lyguspratensis(Linnaeus)]、中黑盲蝽(AdelphocorissuturalisJakovlev)、三點盲蝽(AdelphocorisfasciaticollisReuter)等幾種[5],并且有逐年加重趨勢,而國內對盲蝽有效的Bt殺蟲基因的研究尚未見正式報道。因此,開展對棉盲蝽具有殺蟲活性的Bt菌株及基因篩選對棉花害蟲的綠色防控具有重要意義。

本研究在建立綠盲蝽生物活性測定方法的基礎上,利用本實驗室分離保存的Bt菌株及其殺蟲基因進行綠盲蝽殺蟲活性篩選,獲得一個對綠盲蝽有效的殺蟲基因，最終篩選出20株對綠盲蝽具有活性的Bt菌株,并完成了對部分活性菌株殺蟲基因和蛋白的鑒定。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株和質粒

本研究用到的菌株和質粒見表1。

表1　菌株與質粒

1.1.2培養基

液體LB培養基:胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,調pH至7.0,121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑和儀器

高分子量蛋白marker(high molecular mass range marker)與低分子量蛋白marker (low molecular mass range marker)購自伯樂(BioRad)公司;鎳親和層析柱填料(chelating sepharose fast flow)購自GE公司;胰蛋白酶(1∶250)購自Amresco公司;BSA標準品購自Thermo scientific公司。主要儀器包括:美國Beckman公司高速離心機Avanti J-26xp、德國Eppendorf公司臺式離心機5415C、美國Bio-Rad公司Mini protein Ⅲ蛋白電泳儀、美國GE公司高效液相色譜系統AKTA avant 25、美國Cole-Parmer公司超聲波破碎儀CP750、美國Spex公司高通量組織研磨儀Geno/Grinder 2010。

1.1.4供試昆蟲

綠盲蝽由中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲研究組在室內周年飼養,飼養方法與條件參見陸宴輝等[14]。

1.2試驗方法

1.2.1Bt蛋白對綠盲蝽的生物活性測定

將酶解消化后的Bt蛋白加入綠盲蝽人工飼料中[15],均勻混合后,制成膠囊,對綠盲蝽進行生物活性測定,在生物活性測定過程中,每個處理設置了3個重復,每個重復接10頭綠盲蝽若蟲,將制成的膠囊分別放入各自編號的透明玻璃指形管中(高8.0 cm，直徑2.0 cm),然后將1日齡若蟲接入到試管中,接好若蟲的試管用棉花塞封好,防止若蟲逃逸,然后將試管置于人工氣候箱中,溫度為(26±1)℃,相對濕度為60%～70%,光照為L∥D=14 h∥10 h。2 d更換一次人工飼料,每天觀察并記錄綠盲蝽若蟲存活的情況[16]。

1.2.2Cry15Aa蛋白的表達與提取

將攜帶cry15Aa[13]基因的質粒pEB-15Aa轉入大腸桿菌Rosetta(DE3)中,篩選陽性菌落,接種于5 mL LB液體培養基(含有氨芐青霉素和氯霉素)培養8 h左右,轉接入300 mL LB液體培養基(含有氨芐青霉素和氯霉素)中培養至A600為0.5時,加入終濃度為1 mmol/L IPTG,分別在16、30℃下150 r/min,12 h,比較在16℃和30℃下,Cry15Aa蛋白在大腸桿菌中的誘導表達量。Cry15Aa蛋白在大腸桿菌中的表達與提取參見Zhou等[17]的方法。SDS-PAGE電泳分析Cry15Aa蛋白的表達情況。

1.2.3Cry15Aa蛋白的親和層析純化

將Cry15Aa蛋白的可溶組分通過鎳親和層析柱,進行親和層析純化,具體參見Guo等[18]的方法。SDS-PAGE檢測洗脫下來目的蛋白Cry15Aa的純度。

1.2.4Cry15Aa蛋白對綠盲蝽的生物活性測定

Cry15Aa蛋白的凝膠過濾純化:利用AKTA avant蛋白液相分析系統對經過親和層析純化得到的Cry15Aa蛋白溶液進行緩沖液的置換(脫鹽除咪唑)。將目的蛋白以2 mL/min的流速通過G25脫鹽層析柱,然后用置換緩沖液20 mmol/L Na2CO3/NaHCO3(pH 10.0)以2 mL/min進行洗脫,分體積收集樣品進行SDS-PAGE檢測并定量。

SDS-PAGE分析與定量:收集的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析,SDS-PAGE分析參見薩姆布魯克·J等[19]的方法,并以BSA蛋白為標準、利用National Institutes of Health的Image J(1.44)軟件對蛋白條帶進行定量,參見Image J User Guide 1.44使用方法。

按照1.2.1所述的方法測定經凝膠過濾純化的Cry15Aa蛋白對綠盲蝽的生物活性。

1.2.5Bt菌株殺蟲蛋白的提取、酶解與純化

Bt蛋白的提取:將活化的Bt菌株均勻涂布于LB平板上,30℃培養至菌體裂解。收集菌體,懸浮于30 mL滅菌水中;置于高通量研磨儀,1 600 g、5 min進行振蕩破碎;4℃、8 000 g離心10 min,棄上清;沉淀用30 mL預冷的1 mol/L NaCl懸浮,高通量研磨儀振蕩,離心,沉淀用15 mL預冷的滅菌水懸浮,即獲得胞晶混合物。加入15 mL裂解液,高通量研磨儀振蕩混勻(條件同上),4℃裂解過夜;4℃、8 000 g離心10 min,轉移上清液,加入1/10體積的4 mol/L NaAc(pH=4.5),混勻,冰上放置1 h;4℃、8 000 g離心10 min,收集沉淀,25 mL預冷的滅菌水反復沖洗多次,最終收集的沉淀用50 mmol/L Na2CO3(pH=10.0)溶液溶解。

酶解與純化:取1.5 mL蛋白樣品,胰蛋白酶(250 U)與蛋白樣品以質量比1∶10混合后,37℃溫育3 h;酶解后的蛋白樣品4℃、15 000 g離心15 min,取上清液經G25脫鹽柱去除胰蛋白酶、短肽等雜質。

1.2.6Bt菌株蛋白的質譜鑒定

對綠盲蝽具有殺蟲活性菌株酶解后的蛋白,進行SDS-PAGE分析,切取部分蛋白條帶送往北京華大蛋白質研發中心有限公司進行質譜鑒定。

1.2.7cry15Aa與cry51Aa2基因的PCR檢測

根據1.2.1的測定結果選擇對綠盲蝽具有殺蟲活性的Bt菌株,參照Shu等的方法[20]提取其基因組DNA,以Bt菌株基因組DNA為模板,利用所設計的cry51Aa2引物(F:5′-TTGGCAATTTTAGATTTAAAATC-3′;R:5′-TTAATTTGTTTTTATTGGACTTGTTGG-3′)和Primer star高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。反應條件為:95℃預變性4 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min,30個循環。對綠盲蝽具有殺蟲活性菌株中的cry51Aa2基因進行PCR檢測。cry15Aa基因檢測引物與PCR條件參考文獻[13]進行。

2　結果與分析

2.1Cry15Aa蛋白的提取與純化

利用實驗室克隆的cry15Aa基因進行IPTG誘導表達,通過SDS-PAGE分析發現(如圖1所示),當IPTG濃度為1.0 mmol/L,誘導溫度為30℃時,Cry15Aa蛋白獲得了較高的表達量,并且在可溶組分與非可溶組分中均有約50 ku條帶表達(泳道3和6)。

進一步將離心收集的Cry15Aa蛋白的可溶組分進行鎳柱親和層析純化,SDS-PAGE電泳結果顯示,最終洗脫下分子量約為50 ku的Cry15Aa蛋白(圖2)。理論上cry15Aa基因的表達應獲得分子量約為35 ku的蛋白,分析這可能與蛋白在大腸桿菌表達體系中折疊異常有關。

圖1　不同溫度下Cry15Aa蛋白表達的SDS-PAGE分析結果Fig.1　SDS-PAGE analysis of the expression of Cry15Aa protein in E.coli Rosetta (DE3) at different temperatures

2.2Cry15Aa蛋白對綠盲蝽的生物活性測定結果

經凝膠過濾純化的Cry15Aa蛋白進行定量分析后,終濃度為0.12 mg/mL,對綠盲蝽進行生物活性測定,初步生測結果顯示:以20 mmol/L Na2CO3/NaHCO3(pH 10.0)緩沖液為空白對照(死亡率為23.3%),綠盲蝽的死亡率為46.7%,校正死亡率為30.5%。說明Cry15Aa蛋白對綠盲蝽具有一定的活性。

圖2　Cry15Aa蛋白鎳柱親和層析純化的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of purified Cry15Aa polypeptides with nickel affinity chromatography column

2.3Bt菌株殺蟲蛋白的制備與對綠盲蝽的生物活性

將實驗室分離的360株Bt菌株培養至芽胞晶體釋放,提取蛋白,將提取的Bt蛋白進行酶解純化,然后對綠盲蝽進行生物活性測定,進行活性篩選。根據綠盲蝽Bt蛋白生物活性測定的試驗結果,計算校正死亡率,最終篩選出校正死亡率大于40%的Bt菌株20株(表2)。

表2　Bt菌株蛋白對綠盲蝽生物活性測定結果1)

1) CK-為50 mmol/L Na2CO3(pH=10.0)處理,死亡率為26.7%。

CK-:treatment with 50 mmol/L Na2CO3(pH=10.0); the mortality of CK-is 26.7%.

2.4對綠盲蝽具有殺蟲活性Bt菌株的蛋白鑒定

利用Cry15Aa與cry51Aa2基因的引物對20株Bt菌株進行PCR檢測,發現20株Bt菌株中并不含有已經報道的對盲蝽具有殺蟲活性的Cry15Aa與cry51Aa2基因。

對所提取的20株Bt菌株蛋白酶解消化,進行SDS-PAGE分析,結果發現,13株菌株C8-E3、C8-D6、C8-B7、C8-B6、B15-A5、C9-E4、B16-D2、C12-C4、C7-A10、C7-A9、P13-F5、B15-E1和C9-F2獲得了60 ku的片段;菌株C12-F2、P13-F2、C12-F7、P13-E2、P12-C3、C7-E5和P13-D2菌株只有小條帶,而且并不突出(圖3)。對切取的部分條帶進行LC-MS/MS質譜分析,圖中黑色方框(1～26)即為選取質譜鑒定的條帶。20株菌株中共有11株經質譜分析獲得結果,利用Mascot在Bt殺蟲蛋白庫中對進行本地數據庫檢索,結果發現,僅8株菌株(B15-A5、C9-E4、C7-A9、P13-F5、B15-E1、P13-E2、C9-F2、P12-C3)中可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be和Cry8Ha等蛋白的片段(表3)。除此之外,菌株P13-F5、P13-E2、C9-F2和P12-C3中還檢測到了Cry15Aa蛋白的片段,雖然Cry15Aa蛋白序列覆蓋度較低。

圖3　胰蛋白酶消化后的Bt蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of Bt proteins digested with trypsin

菌株編號Strainno.條帶編號Bandno.殺蟲蛋白Insecticidalprotein得分Score匹配肽段/個Matches覆蓋度/%CoverageB15-A513Cry1Aa25528120Cry1Ab18276620C9-E415/16Cry1Ac410716828Cry1Aa299612821Cry1Ae224210117C7-A917Cry1Ac852933628Cry1Aa680525825Cry1Af566223231Cry1Ae553623717P13-F519Cry15Aa3888851520Cry15Aa34468316B15-E121Cry1Aa31284 83337Cry1Ag23293 62424Cry1Ae10214 31717Cry1Ah891826024Cry1Be431512530Cry1Ba20305610P13-E222Cry1Aa677917223Cry1Ag591714915Cry1Be20987917Cry1Ah14095110Cry15Aa2032689C9-F223Cry8Ha54851548Cry1Aa432911723Cry1Be16436712Cry15Aa20016620P12-C324Cry1Aa28161032225Cry1Aa17497315Cry15Aa1109536

1) 匹配肽段數目大于50即為有效。

The number of matches is effective when it is more than 50.

3　討論

轉基因抗蟲棉的廣泛種植,有效地控制了棉花害蟲的危害,減少了農藥的使用,帶來了巨大的經濟效益與生態效益[21]。因此,篩選對棉花害蟲高效的Bt殺蟲基因具有重要的意義。然而,自1997年我國開始商業化種植轉Bt基因棉以來,棉田化學農藥使用量因此而大幅度減少,減弱了對盲蝽等轉基因棉花非靶標害蟲的控制,使之成為棉花的主要害蟲[9, 22],因此,針對棉盲蝽等刺吸式口器害蟲篩選有效的Bt菌株及殺蟲基因是目前一項緊迫的研究工作。

盲蝽成蟲以口針刺吸棉株嫩葉、幼芽、幼嫩花蕾的汁液為害,因此,Bt胞晶混合物難以直接用于殺蟲活性測定。本研究針對綠盲蝽刺吸取食這一特點,利用中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組建立的人工飼料測定方法,進行了Bt純化蛋白的殺蟲活性評估[1516],盡管對照害蟲存在較高的死亡率,但是與對照組相比,360株Bt菌株中,有20株菌株表現出顯著的殺蟲效果。上述結果說明,雖然人工飼料測定方法仍需進一步改進,但是已經可以用于盲蝽有效Bt菌株與基因的初步評估,對當前相關研究工作有重要的促進作用。

近年來研究發現Cry51Aa是一類對盲蝽具有活性的Bt殺蟲蛋白[12],Cry51Aa屬于Mtx類殺蟲蛋白,結構上與目前廣泛應用的Cry1A類殺蟲蛋白不同。因此,本研究利用實驗室此前克隆的Mtx類殺蟲蛋白基因cry15Aa對綠盲蝽進行殺蟲活性研究,結果顯示Cry15Aa蛋白對綠盲蝽具有一定的殺蟲活性。Cry15Aa于1992年首次在蘇云金芽胞桿菌HD542中被發現,可以形成菱形晶體[23],在HD542中表達的Cry15Aa蛋白大小約35 kDa[24],對鱗翅目害蟲蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)、煙草天蛾(Manducasexta)和菜青蟲(Pierisrapae)都有一定的殺蟲活性[25],本研究發現,其與另外一個Mtx蛋白Cry51Aa相似,對半翅目害蟲盲蝽也有一定的殺蟲活性。

為了對盲蝽有效的Bt菌株中可能含有的殺蟲蛋白進行鑒定,對上述菌株進行了LC-MS/MS質譜分析,在B15-A5、C9-E4、C7-A9、P13-F5、B15-E1、P13-E2、C9-F2和P12-C3等菌株中檢測到Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等對鱗翅目、鞘翅目害蟲有效的Bt殺蟲蛋白的片段；在P13-F5、P13-E2、C9-F2和P12-C3中檢測到了Mtx類蛋白Cry15Aa的片段,說明這些菌株中可能含有Cry15Aa類似的蛋白。進一步PCR鑒定結果表明上述菌株中并不含有已知的cry15Aa與cry51Aa基因,顯示這4株菌株中可能含有Cry15類的新基因。上述研究結果表,本研究篩選獲得的20株Bt菌株中可能含有對綠盲蝽具有殺蟲活性的新基因。

總之,本研究針對日益嚴重的棉花害蟲盲蝽開展Bt菌株篩選與鑒定研究,篩選獲得了對綠盲蝽具有一定殺蟲活性的基因1個,對綠盲蝽有效的Bt菌株20株,這些研究結果對綠盲蝽的防治具有重要的意義。

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(責任編輯：田喆)

Screening of Bt isolates with insecticidal activity againstApolyguslucorum(Heteroptera:Miridae)and bioassay of Cry15Aa polypeptides

Zhang Xuewen1,2,Shu Changlong2,Lu Yanhui2,Liu Chunying2,Zhang Jie1,2,Gao Jiguo1

(1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin150030, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

Transgenic cotton withcrygenes has controlled the main cotton pests (Helicoverpaarmigera) effectively, however another non target mirid bugs (Heteroptera: Miridae) with sucking mouthparts have increased population sizes year by year. It has not been reported to the effective insecticidal genes ofBacillusthuringiensisagainstApolyguslucorum(Meyer-Dür), in this study, Bt insecticidal genes and isolates stored in our laboratory were prepared to assay the insecticidal activity againstA.lucorum. Thecry15Aagene which belongs to Mtx in our lab was used to perform the bioassay toA.lucorum, the result showed that Cry15Aa polypeptides was certain insecticidal activity againstA.lucorum. After bioassay againstA.lucorum, twentyA.lucorumtoxic Bt isolates were obtained. The LC-MS/MS identification showed these isolates might contains Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ae, Cry1Af, Cry1Ag, Cry1Ah, Cry1Ba, Cry1Be, Cry8Ha and other proteins which are insecticidal to lepidoptera and coleopteran pests, and four of them contains peptide fragment similar to Cry15Aa which belong to Mtx protein. But subsequence gene identification results indicated that these isolates not contains full lengthcry15Aagene, it suggested that these isolates contains newcry15 type genes. The results indicated that these Bt isolates may contain new insecticidal proteins toxic to mirid bugs. The obtaining of novel Bt isolates and the discovery of Cry15Aa with insecticidal activity againstA.lucorumare significant to the biological control forA.lucorum.

Bacillusthuringiensis;Apolyguslucorum;insecticidal activity;LC-MS/MS identification;Cry15Aa polypeptides

20150414

20150519

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800912B)

E-mail:shuchanglong@sina.com,gaojiguo1961@hotmail.com

S 433.3,S 476.1

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.009