四川省小麥條銹菌耐高溫性鑒定及其cDNA文庫構建

王金鑫,　吳艷琴,　王鳳濤,　馮　晶,　藺瑞明,　徐世昌

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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四川省小麥條銹菌耐高溫性鑒定及其cDNA文庫構建

王金鑫,吳艷琴,王鳳濤,馮晶,藺瑞明*,徐世昌

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

近年條銹菌越夏調查發現,小麥條銹菌耐高溫性增強,越夏海拔下限有所降低。本研究通過在高溫(21±0.2)℃條件下接種,評價了119個來自四川省的條銹菌菌株耐高溫性,并構建了耐高溫菌株SC-PX143萌發夏孢子的cDNA文庫。結果發現來自四川的條銹菌群體中耐高溫菌株占35.3%,主要分布在成都市、涼山市、簡陽市和廣元市。夏孢子萌發率統計分析表明,耐高溫菌株在高溫條件下比溫度敏感菌株具有更高的萌發率。采用SMART技術構建了耐高溫菌株萌發夏孢子cDNA文庫,庫容為2.1×106cfu,插入片段平均多大于1.0 kb。本研究結果初步明確了四川省小麥條銹菌群體中耐高溫菌株組成和分布區域,不同菌株在夏孢子萌發階段對高溫的耐受性存在顯著差異,為進一步研究條銹菌耐高溫機制奠定基礎。

小麥條銹菌;耐高溫性;夏孢子萌發率;cDNA文庫

小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥專化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌病害,在流行暴發年份能造成嚴重的產量損失[1]。在大規模種植感病品種的地區,如遇到低溫、潮濕的氣候條件以及充足的初侵染菌源,極易引起條銹病大規模暴發流行。小麥條銹病是典型的低溫病害,但近年來在條銹菌越夏區調查中發現,條銹菌越夏海拔下限逐年下降[2]。甘肅省平涼市夏季最熱旬平均溫度超過23℃的年份也存在越夏菌源[3]。Milus等發現美國2000年之后的菌株比2000年之前的菌株具有更強的高溫適應性,具體表現在潛伏期更短,產孢量更大[4]。另外,張靜秋等對我國不同地區條銹菌溫度敏感性分析發現存在耐高溫菌株[5]。耐高溫條銹菌菌株的出現可能對我國未來小麥條銹病的發生、流行危害以及制定相應的防治策略產生深遠影響,并帶來新的挑戰。然而,有關耐高溫小麥條銹菌在我國各主要流行區域的分布范圍、耐高溫性,及其與毒性變異關系和調控機制等尚不清楚。

構建病原菌cDNA文庫是克隆關鍵基因的基礎性工作,已有學者構建了小麥條銹菌吸器、萌發10 h的夏孢子cDNA文庫[67],而且目前已完成了小麥條銹菌基因組和轉錄組測序分析[89],這些基礎性工作為研究條銹菌侵染過程中基因克隆、表達及功能驗證奠定了基礎。本研究分析了來自四川省條銹菌群體中耐高溫菌株分布情況,篩選獲得了具有耐高溫特性的條銹菌菌株,構建了在高溫脅迫條件下耐高溫菌株萌發的夏孢子cDNA文庫并對其質量進行了評價,為克隆與條銹菌耐高溫性狀相關的基因,揭示其在條銹菌耐高溫機制調控中的功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株:2012-2014年分離的來自四川省的119個條銹菌菌株。

供試試劑:SMARTTMcDNA文庫構建試劑盒,Advantage 2 Polymerase Mix試劑盒,日本Clontech公司;SfiⅠ酶,NEB有限公司(北京);pUC19載體,蛋白酶K,T4 DNA連接酶,日本TaKaRa公司;瓊脂粉,瓊脂糖,Amp,IPTG,x-gal,北京科昊達生物技術公司。

培養基:水瓊脂培養基(瓊脂粉10 g,加水定容到400 mL,121℃高壓蒸汽滅菌20 min),Luria-Bertani(LB)固體培養基(胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,水溶解后,用NaOH調pH至7.0,瓊脂15 g,加水定容到1 L, 121℃高壓蒸汽滅菌20 min),使用前加入抗生素(100 mg/L Amp)和GUS基因表達選擇底物和誘導劑(50 mg/mL IPTG,20 mg/mL x-gal)。

供試儀器:研究級生物顯微鏡(BX63),日本奧林巴斯公司;紫外分光光度計(ND-2000),美國Thermo公司;光照培養箱(MLR-352H),購自日本三洋公司;PCR儀(MyCycle),美國Bio-Rad公司。

1.2方法

耐高溫菌株篩選:感病品種‘銘賢169’播種于直徑10 cm花盆中,每盆30株,基質為草炭土與麥田土按1∶1混合,適量補充有機肥,待出苗1周后,利用掃抹法,即用‘銘賢169’擴繁的菌株夏孢子直接掃抹于第1葉充分展開的‘銘賢169’幼苗上,在(21±0.2)℃接種桶中黑暗保濕24 h,相對濕度100%,然后轉移至18/25℃(夜/晝)溫室中繼續潛育培養,光照強度8 000～12 000 lx,光周期L∥D=8 h∥16 h。接種15 d后調查發病嚴重程度。嚴重度劃分標準參考商鴻生等的方法[10],依據嚴重度確定測試菌株的耐高溫性。在本研究中發病嚴重度達到40%以上的菌株即為耐高溫菌株,發病嚴重度在0～5%的菌株即為溫度敏感菌株。

耐高溫菌株夏孢子擴繁和樣品制備:將耐高溫菌株SC-PX143在‘銘賢169’幼苗上經過連續5次以上高溫條件下繼代培養,確認該菌株具有良好并穩定的耐高溫特性。利用‘銘賢169’幼苗在常溫條件下擴繁夏孢子,具體方法是:菌種直接掃抹于第1片葉完全展開的‘銘賢169’幼苗上,接種后于(10±0.2)℃黑暗保濕24 h,然后轉移到13～16℃(夜/晝)溫室中潛育培養,相對濕度80%,光照強度8 000～12 000 lx,光周期L∥D=16 h∥8 h。接種后約14 d收集成熟的夏孢子。準備2.5%水瓊脂培養基平板(13 cm×13 cm),每皿培養基約50 mL。用無菌水配制濃度為2.5 mg/mL新鮮夏孢子懸浮液,每皿內均勻涂抹2 mL孢子懸浮液。在室溫條件下放置約5～10 min,轉移至(21±0.2)℃培養箱中培養8 h后,迅速用載玻片刮取收集萌發的夏孢子及其芽管,在液氮中保存備用。

孢子萌發:以SC-PX143為供試菌,以溫度敏感菌株ZBTX14011為對照菌株,新鮮夏孢子分別在最適萌發溫度即常溫(10±0.2)℃和高溫(21±0.2)℃條件下保濕萌發8 h后,顯微鏡下檢測并統計常溫及高溫條件下孢子萌發情況,3次重復。

耐高溫菌株SC-PX143萌發夏孢子總RNA提取與cDNA合成:采用SDS法(抽提緩沖液組成:0.02 mol/L Tris-HCl pH=8.0;0.2 mol/L NaCl;0.005 mol/L EDTA;1% SDS)提取條銹菌萌發夏孢子總RNA,用1.2% 變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,紫外分光光度法測定其濃度和A260/A280。按照SMARTTMcDNA文庫構建試劑盒說明書反轉錄合成cDNA第一條鏈,再根據Advantage 2 Polymerase Mix試劑盒說明書PCR合成cDNA第二條鏈。

cDNA片段與文庫載體連接及轉化:將cDNA電泳分級后,只保留500 bp以上的片段。用蛋白酶K消化稀釋后的雙鏈cDNA,再以SfiⅠ酶切,通過酚-氯仿(1∶1,V∶V)抽提并用70%乙醇沉淀后,獲得純化的cDNA片段。取5 μL cDNA片段、1 μL pUC19載體和1 μL T4 DNA連接酶混合后,于14℃連接過夜。取1 μL連接產物與大腸桿菌(E.coli)DH-5α菌株感受態細胞輕輕混勻,冰浴20 min后42℃熱激轉化,37℃振蕩培養45 min,轉速200 r/min,取200 μL菌液均勻涂布于直徑15 cm LB固體培養基平板上,在37℃培養箱中培養過夜。

文庫質量鑒定:統計轉化的單菌落數量,測定文庫的庫容量和滴度,并用GUS基因表達篩選結果(即產生藍斑或白斑篩選法)統計平板上長出白斑及藍斑的數量及其比值,測定文庫的重組率。隨機挑取單克隆菌落,以M13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)和M13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)引物組合做菌落PCR擴增,檢測插入cDNA片段大小。

1.3數據分析

用SAS軟件對(10±0.2)℃及(21±0.2)℃條件下孢子萌發率3次重復試驗t檢驗分析,確定差異是否顯著。

2　結果與分析

2.1四川省小麥條銹菌耐高溫性分析

在高溫條件下(21±0.2)接種保濕后繼續在18～25℃溫室中潛育培養,對采自四川省的119份小麥條銹菌標樣進行了接種時期耐高溫性鑒定(表1),依據發病嚴重度,發現來自四川省菌株在高溫接種(21±0.2)℃條件下發病嚴重度達到40%以上的菌株有42株,占總菌株數35.3%,劃分為耐高溫菌株,主要集中分布在成都市、涼山市、簡陽市和廣元市;來自綿陽市的耐高溫菌株所占比例為22.9%,低于上述4個地方的耐高溫菌株的占比例;而來自川西北阿壩州耐高溫菌株所占比例最低。其中20.2%的菌株在高溫條件下接種不能成功侵染、產孢。17.6%的菌株發病嚴重度為1%～5%;26.9%菌株發病嚴重度為10%～20%。在篩選到的耐高溫菌株中,分離自四川郫縣的菌株SC-PX143在高溫下發病嚴重度達80%以上且耐高溫性狀穩定,因此本研究選用該菌株為后續試驗研究對象,構建了該菌株萌發夏孢子的cDNA文庫,為后續菌株耐高溫性研究奠定基礎。

表1　四川省小麥條銹菌耐高溫性篩選

2.2小麥條銹菌夏孢子高溫脅迫萌發

由于接種溫度顯著影響了菌株的侵染,因此我們在水瓊脂培養基上觀察不同溫度下孢子的萌發率。統計分析發現,耐高溫菌株SC-PX143和溫度敏感菌株ZBTX14011在常溫(10±0.2)℃保濕培養8 h后平均萌發率分別達到92.2%和88.9%,兩者差異不顯著;而在高溫(21±0.2)℃保濕培養8 h后平均萌發率分別為75.5%和36.5%。高溫條件下2個菌株孢子萌發率差異極顯著(P<0.01),SC-PX143菌株夏孢子萌發具有較強的耐受高溫脅迫能力(圖1a～c)。

圖1　溫度敏感型不同的小麥條銹菌夏孢子萌發Fig.1　Germination of the urediospores of Puccinia striiformis f.sp. tritici with different temperature sensitivities

2.3總RNA完整性檢測及雙鏈cDNA合成

利用CTAB法提取小麥條銹菌萌發夏孢子總RNA,經測定A260/A280值為2.28。經變性瓊脂糖凝膠電泳檢測,其28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,其亮度比接近2∶1,說明提取的RNA比較完整,其濃度及純度均滿足構建cDNA文庫的要求(圖2a)。將提取的小麥條銹菌萌發夏孢子總RNA作為反轉錄模板,獲得雙鏈cDNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,雙鏈cDNA片段長度主要集中分布在500～2 000 bp范圍內(圖2b),分離并保留500 bp以上的cDNA片段用于文庫構建。

圖2　萌發夏孢子總RNA及合成雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2　The agarose gel electrophoresis of the total RNA and its double-strand cDNA of germinated urediospores

2.4文庫質量鑒定

重組文庫經藍白斑篩選,每皿菌落數平均為750個,其中藍斑49個,得到文庫的庫容量為2.1×106cfu/mL,重組率為93.5%。隨機挑取文庫中48個單克隆,根據載體克隆位點兩端的測序引物進行PCR擴增鑒定,結果顯示擴增條帶主要集中分布在750～2 000 bp范圍內,其中4個克隆插入片段大小在500～750 bp,15個克隆插入片段大小在750～1 000 bp,29個克隆插入片段大小在1 000～2 000 bp,平均長度1 000 bp左右(圖3)。

3　討論

小麥條銹病屬于典型的低溫冷涼病害,環境溫度是決定病原菌能否成功侵染寄主的關鍵因素之一。但隨著全球氣候變暖,小麥條銹菌毒性頻繁變異以適應抗病性不同的小麥品種更替,同時還要適應高溫等環境脅迫因子的變化。

四川省是小麥條銹菌重要越夏區和冬繁區。近年來,暖冬現象的出現使冬季氣溫偏高,造成冬前小麥條銹菌不斷侵染、繁殖,導致菌源基數擴大。張靜秋等[5]發現2010-2011年四川省小麥條銹菌平均ET50為24.53℃,而同時期來自寧夏的菌株ET50僅為19.79℃。四川省4月中、下旬及5月上旬為當地條銹病春季流行期,高溫環境會對條銹菌產生選擇壓力,長期選擇積累,使條銹菌增強了對高溫脅迫的耐受能力,導致耐高溫菌株出現頻率增加;8-9月條銹菌越夏期間高溫環境會對耐高溫菌株進一步篩選,從而使當地小麥條銹菌群體耐受高溫脅迫的能力增強。本研究通過對四川省小麥條銹菌耐高溫性鑒定,在高溫條件下接種和潛育培養,發現發病嚴重度達到40%以上的菌株占35.3%,且在省內不同地區均有分布,主要集中在成都、涼山、廣元和簡陽,耐高溫菌株出現頻率較高,而在海拔相對較高的阿壩州耐高溫菌株出現的頻率較低,這說明小麥條銹菌耐高溫菌株的出現是長期高溫環境選擇的結果,在四川省東部海拔相對較低、且常年氣溫較高的地區出現的頻率高,但在高海拔、氣候冷涼川西北地區則分布較少。

圖3　cDNA文庫中插入片段瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.3　The agarose gel electrophoresis of the cDNA fragments of the cDNA library

高溫對小麥條銹菌夏孢子萌發的影響研究中發現,隨著溫度增高,條銹菌夏孢子萌發率逐漸降低。例如CY32號小種在20℃下萌發率高達69.02%,26℃萌發率低于10%[11]。本研究中,耐高溫菌株SC-PX143和溫度敏感菌株ZBTX14011在高溫條件下(21±0.2)℃保濕8 h后夏孢子萌發率差異極顯著,而且耐高溫菌株在高溫條件下接種感病品種‘銘賢169’幼苗發病嚴重度達到80%以上,說明耐高溫菌株夏孢子在萌發過程就具有較高的耐受高溫脅迫能力。

研究小麥條銹菌夏孢子萌發這一重要侵染過程中的基因表達情況,對于從分子水平揭示條銹菌的致病機理具有重要價值,但有關溫度對小麥條銹菌侵染過程影響的研究目前還沒有取得任何進展。條銹菌基因組大小約64.8 Mb(美國Pst-130菌株)至110 Mb(中國CY32號小種)[89],預測其編碼25 288個基因。轉錄組測序是分析基因表達調控途徑非常有效的技術,可以揭示病原菌-寄主植物互作過程中特殊表達的基因。Garnica等對小麥條銹菌吸器及萌發的夏孢子轉錄組進行測序,通過比較兩者基因表達差異情況,明確在條銹菌成功侵入小麥過程中發揮作用的基因功能[12]。本研究組已利用轉錄組測序技術分析耐高溫菌株和溫度敏感菌株在夏孢子萌發及侵染過程中的基因表達差異,獲得參與條銹菌高溫脅迫的相關基因。因此,本研究中構建了耐高溫菌株在高溫脅迫條件下萌發夏孢子的cDNA文庫,便于克隆和研究調控條銹菌在萌發和侵染過程中適應高溫脅迫的相關基因,為進一步研究小麥條銹菌耐高溫機制奠定基礎。

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(責任編輯：田喆)

Identification of high-temperature tolerance ofPucciniastriiformisf.sp.triticiin Sichuan Province and the cDNA library construction

Wang Jinxin,Wu Yanqin,Wang Fengtao,Feng Jing,Lin Ruiming,Xu Shichang

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

In the oversummering surveys of stripe rust pathogen in recent years, it was found that high-temperature tolerance of the pathogen has been enhanced and the lowest elevation of the oversummering areas declined. In this study, we inoculated stripe rust isolates at high temperature (21±0.2)℃ to assay the high-temperature tolerance of 119 stripe rust isolates from Sichuan Province, and constructed a cDNA library of the germinated urediospores of a high-temperature tolerant strain SC-PX143. The results showed that 35.3% of the 119 isolates were high-temperature tolerant, mainly distributed in Chengdu, Liangshan, Jianyang and Guangyuan. In addition, high-temperature tolerant isolates had a higher germination rate under high temperature (21±0.2)℃ than the temperature sensitive ones. SMART technology was used to construct a cDNA library with the germinated urediospores of a high-temperature tolerant isolates. The total capacity of the cDNA library was 2.1×106cfu, and most insert cDNA fragments were more than 1.0 kb in length. We preliminarily made clear the composition and distribution areas of high-temperature tolerant wheat stripe rust strains from Sichuan, and there was significant difference in high-temperature tolerance of stripe rust strains during urediniospore germination stage. These results will promote the further studies of high-temperature tolerance mechanism of wheat stripe rust pathogen.

wheat stripe rust;high temperature tolerance;urediniospore germination rate;cDNA library

20150430

20150530

國家重點基礎研究發展計劃(2013CB127700); 公益性行業(農業)科研專項(201303016);農業部作物種質資源保護與利用專項(2014NWB030-14)

E-mail:linruiming@caas.cn

S 435.121.42, Q 933

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.011