菜青蟲感染金龜子綠僵菌后體內幾種保護酶活性的變化

李世廣,　竇婷婷,　付小伶,　劉祝琴,　何　超

(安徽農業大學植物保護學院, 合肥　230036)

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菜青蟲感染金龜子綠僵菌后體內幾種保護酶活性的變化

李世廣*,竇婷婷,付小伶,劉祝琴,何超

(安徽農業大學植物保護學院, 合肥230036)

為了明確菜青蟲感染金龜子綠僵菌后體內的防御機制,采用分光光度法測定了菜青蟲被金龜子綠僵菌感染后體內保護酶活性的變化。結果表明,用金龜子綠僵菌處理后菜青蟲體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)均呈現先上升后下降趨勢,反映出菜青蟲在金龜子綠僵菌侵染初期防御能力增強,后期降低。其中,SOD、POD和CAT活力分別在接種后36、24和48h達到高峰,說明菜青蟲在抵抗金龜子綠僵菌侵染過程中,首先發生作用的保護酶是POD,隨后為SOD,而CAT是最后發生作用的保護酶。

菜青蟲;金龜子綠僵菌;超氧化物歧化酶;過氧化物酶;過氧化氫酶

LiShiguang,DouTingting,FuXiaoling,LiuZhuqin,HeChao

菜青蟲為鱗翅目粉蝶科菜粉蝶(Pieris rapae)的幼蟲,是十字花科植物的重要害蟲,除啃食葉肉為害之外,還可引起軟腐病的流行,危害十分嚴重[1]。

目前,我國對于農業害蟲的防治還集中于化學防治上,但大量化學農藥的使用已經使得環境不堪重負,在害蟲產生抗藥性的同時,大量的農藥殘留也對人類自身的健康產生極大的威脅。因此,尋找能夠有效防治農業害蟲的生物方法顯得尤為重要。綠僵菌[Metarhizium (Metsch.)Sorokin]是一類廣譜性蟲生真菌,能侵染200多種農林害蟲,對人、畜、作物安全[23]。國內外運用綠僵菌防治農業害蟲的研究已有不少報道[4],有關昆蟲保護酶的研究報道也有很多,但大多數還集中在昆蟲保護酶與昆蟲抗藥性關系之間的研究[57]。關于昆蟲病原真菌與昆蟲保護酶關系的研究也略有報道[810]。而被綠僵菌侵染后菜青蟲體內保護酶活性變化尚未見報道。

以往的研究表明,菜青蟲體內存在著超氧化物歧化酶(superoxide,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和過氧化物酶(peroxidase,POD)等保護酶。當昆蟲病原真菌附著在菜青蟲體壁,菌絲進入血腔后,菜青蟲會啟動機體內的保護酶系統進行防御,即菜青蟲體內的SOD、CAT和POD三者協同作用, 使自由基維持在一個較低的水平,從而維持其正常的生理活動[11]。作者利用篩選出的對菜青蟲致病力較高(校正死亡率為96.4%,僵蟲率達84.1%,LT50為2d,尚未發表)的金龜子綠僵菌Ma60菌株,研究了被該菌株侵染后菜青蟲體內幾種保護酶活力的變化,旨在為菜青蟲的生物防治工作提供科學依據。

1　材料與方法

1.1供試菌株

金龜子綠僵菌Ma60菌株,由安徽農業大學植物保護學院生物防治研究室提供。

1.2供試蟲源

菜青蟲采自安徽農業大學農翠園,將其放在安徽農業大學植保學院大棚溫室內的白菜上飼養,待成蟲產卵孵化后轉為室內盆栽白菜飼養,選取健康活潑的4齡幼蟲供試。

1.3真菌分生孢子懸浮液配制

將Ma60菌株接種于PDA培養基平板上,在 (25±1)℃ 條件下培養 10d,待真菌充分產生孢子后,將分生孢子粉刮到盛有 10mL0.1%Tween-80濕潤劑的試管中,在渦旋混勻器上充分振蕩 30min,用血球計數板計數,配制成孢子含量1.0×108個/mL的分生孢子懸浮液。

1.4金龜子綠僵菌對菜青蟲的侵染試驗

將20頭4齡菜青蟲放入培養皿中,用簡易噴霧器將含0.1%Tween-80的1.0×108個/mL的金龜子綠僵菌孢子懸浮液均勻地噴在試蟲體表,待蟲體晾干后,放入裝有白菜葉片的培養皿中,以無菌的0.1%吐溫-80溶液為對照，每處理重復3次,置于溫度22℃、相對濕度90%左右、光周期L∥D=14h∥10h的恒溫光照培養箱內。分別于接菌后12、24、36、48、60、72h取樣，備用。

1.5酶液的制備

試蟲先用生理鹽水漂洗2～3次,并用濾紙去除體表水分。準確稱量試蟲重量,按1∶9(W/V)加入經過遇冷處理的生理鹽水,在冰浴中進行研磨,制成10%組織勻漿液,在4℃下2 500r/min離心10min,取上清液作為待測酶液,放入-20℃冰箱內儲藏備用。

1.6酶活性的測定

酶液蛋白含量、SOD、POD和CAT活性測定均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。每處理均重復3次,求平均值。

1.7數據處理

采用MicrosoftExcel2003進行數據統計和圖表繪制。采用DPS7.05進行方差分析,Duncan新復極差法比較差異顯著性。圖中數據用平均值±標準誤表示。

2　結果與分析

2.1菜青蟲體內SOD活性的變化

經金龜子綠僵菌處理后菜青蟲體內SOD活性變化如圖1所示,測定期間對照組菜青蟲體內不同時間的SOD比活力差異不顯著。但處理組不同時間的SOD比活力差異極顯著(P<0.01),在接菌后12h時略低于對照,隨后逐漸升高,到36h達到最高峰,顯著高于對照組,酶的比活力為同期對照組的1.6倍。感染36h之后體內SOD活力急劇下降,60h及72h顯著低于對照組,分別為對照組的0.83和0.60倍。表明菜青蟲被金龜子綠僵菌侵染后12h,孢子還未萌發,菌絲未侵入體內,所以表現為12h時處理組與對照組之間差異不顯著。而在接菌后24～36h,O2濃度增加,導致蟲體內的HO-濃度大量增加,表現為SOD活力明顯上升,以減輕過氧離子對蟲體的毒害。在感染后期,可能是受金龜子綠僵菌在蟲體內大量繁殖的影響,使得SOD的合成受到抑制,自身防衛能力下降,表現為SOD活力急劇下降并低于正常蟲體。

圖1　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲體內SOD活性的變化Fig.1　Changes of SOD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.2菜青蟲體內POD活性的變化

經金龜子綠僵菌處理后菜青蟲體內POD活性的變化如圖2所示,在接菌后72h內,對照組菜青蟲體內的POD活性無顯著變化。而處理組的POD活性呈先升高后下降趨勢。其中,菜青蟲在染菌后12h,其體內POD比活力與對照組無顯著差異;POD活性在接菌后24h時達到最大,顯著高于對照組,為對照組的1.34倍;隨后緩慢下降,在接菌后36～48h,處理組比活力仍顯著高于對照組,隨后急劇下降,染菌72h后達到最低,顯著低于對照組酶活力。說明菜青蟲被金龜子綠僵菌侵染后,其體內可能產生具有毒性的氧化物質,從而啟動免疫系統合成POD,以維持其正常的生理功能;但在接菌第24h后,由于金龜子綠僵菌菌絲在菜青蟲體內開始萌發,使POD合成受到影響,從而表現為POD活性逐漸下降。

圖2　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲體內POD活性的變化Fig.2　Changes of POD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.3菜青蟲體內CAT活性的變化

經金龜子綠僵菌處理后菜青蟲體內CAT活性的變化如圖3所示,對照組菜青蟲隨著蟲體的生長發育CAT活性無顯著變化。而處理組的CAT活性在接菌后變化較大。接菌后12～24h,菜青蟲CAT活性與對照相比,無顯著差異。從接菌后24h開始,CAT活力顯著上升,由20.374U/mg上升至26.798U/mg,隨后緩慢上升至30.687U/mg(48h),達到最高峰,為對照組的1.55倍。但在接菌48h后緩慢下降,直至72h時略低于對照,且差異不顯著。表明在金龜子綠僵菌侵染初期,菜青蟲體內組織暫時未受到侵染,因而CAT的活力沒有發生明顯的變化;而在侵染后期,蟲體組織遭受嚴重侵染,因此菜青蟲體內的CAT活性提高以抵御病原菌對蟲體產生的毒害;但由于金龜子綠僵菌在蟲體內的生長繁殖速度很快,最終超出其抵御能力，導致菜青蟲的CAT活力逐漸下降。

圖3　感染金龜子綠僵菌后4齡菜青蟲體內CAT活性的變化Fig.3　Changes of CAT activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

3　討論

本試驗結果表明,菜青蟲被金龜子綠僵菌侵染后體內的SOD、POD和CAT酶活性均呈現先升高后降低趨勢。這與李會平等[9]、姬國紅等[15]的報道一致。表明金龜子綠僵菌能有效地干擾菜青蟲體內保護酶的活性,出現這種結果,可能是由于菜青蟲被金龜子綠僵菌侵染后,其體內產生有毒的氧化物質,從而刺激蟲體免疫系統合成相應的保護酶,以抵御有毒物質對蟲體的毒害,進而維持昆蟲體內正常的生理活動;而隨著感染時間的延長,金龜子綠僵菌在蟲體內大量繁殖,破壞了蟲體組織,菜青蟲保護酶的合成機制受到限制,清除自由基的能力降低,或者是由于感病蟲體內自由基過多,自由基產生與清除之間失去平衡,從而引起昆蟲發病甚至死亡。從試驗結果來看,SOD、POD和CAT活力分別在感染后36、24和48h達到最高峰,說明菜青蟲體內的保護酶在對金龜子綠僵菌的免疫過程中,首先發生作用的保護酶是POD,隨后為SOD,而CAT是最后發生作用的保護酶。

綜上所述,用金龜子綠僵菌侵染菜青蟲,能誘導其體內保護酶的活性發生變化,對菜青蟲的生物防治具有一定的意義。本文為探明被金龜子綠僵菌感染后菜青蟲體內的防御機制提供了一定的理論依據,但是為了更好地研究金龜子綠僵菌對菜青蟲的作用機制及菜青蟲體內保護酶的作用方式,還需從分子角度對其進行深入探究。

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(責任編輯：楊明麗)

ChangesofprotectiveenzymeactivitiesinPieris rapaeinfectedbyMetarhizium anisopliae

(SchoolofPlantProtection,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)

AbstractTounderstandthedefensemechanismsofPieris rapaeagainstMetarhizium anisopliae,thisstudyusedspectrophotometrytoassaytheactivitiesofprotectiveenzymesofP.rapaeinfectedbyM. anisopliae.Theresultsindicatedthat,theactivitiesofSOD,PODandCATintheinfectedP.rapaewereincreasedatinitialinfectionstage,butdroppedatthelaterinfectionstage,suggestingthatthedefensesystemofP.rapaewasenhancedduringinitialperiod,butdroppedduringthelaterperiod.ThehighestactivitiesofSOD,PODandCATwereobservedat36hours, 24hoursand48hoursafterinoculation,respectively,whichindicatedthatPODplayedanimportantroleindefendingagainsttheinvasionofM. anisopliae,andthenSODfunctionedafterinvasion,whilethelasteffectiveprotectiveenzymewasCAT.

Pieris rapae;Metarhizium anisopliae;superoxide;peroxidase;catalase

20150604

20150624

“十二五”農村領域國家科技計劃課題(2011BAD12B04-02)；安徽省教育廳重點項目(KJ2015A099)；安徽農業大學學科骨干培育項目(2014XKPY-08)

E-mail:lsg815@163.com

S476.12

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.022