西瓜嗜酸菌趨化性的初步研究

楊姍姍,　孫柏欣,　王鐵霖,　張曉曉,　楊玉文,　趙廷昌

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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西瓜嗜酸菌趨化性的初步研究

楊姍姍,孫柏欣,王鐵霖,張曉曉,楊玉文,趙廷昌*

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

瓜類細菌性果斑病是世界范圍的檢疫性細菌病害,病原菌為西瓜嗜酸菌,帶菌種子為主要侵染源。病原細菌在寄主表面的定殖能力與其致病能力關(guān)系密切,而趨化性是決定定殖能力的關(guān)鍵因素之一,研究不同物質(zhì)對西瓜嗜酸菌趨化性的影響對防治瓜類細菌性果斑病具有重要意義。本文采用毛細管法,研究了碳源、氨基酸、有機酸及其他物質(zhì)對西瓜嗜酸菌趨化性的影響。結(jié)果表明,所測碳源中,麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖均顯著促進西瓜嗜酸菌的趨化性;所測氨基酸中,L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸顯著促進西瓜嗜酸菌的趨化性;所測有機酸中,琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸顯著促進西瓜嗜酸菌的趨化性;氯化鈉、硫酸鎂等對西瓜嗜酸菌的趨化性無顯著影響。

西瓜嗜酸菌;趨化性;毛細管法

瓜類細菌性果斑病(bacterialfruitblotch,簡稱BFB)是世界范圍的檢疫性細菌病害,主要危害西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物,造成重大的經(jīng)濟損失。其病原菌是西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)[1],帶菌種子為主要侵染源。病原細菌在寄主表面的定殖能力與其致病能力關(guān)系密切,而病原細菌的趨化能力是決定定殖能力的關(guān)鍵因素之一。

細菌趨化性是指有運動能力的細菌對化學物質(zhì)及其濃度梯度做出的反應,使細菌趨向有益刺激,逃避有害刺激。細菌的趨化性受復雜的趨化信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)調(diào)控,與細菌致病性有密切的關(guān)系[2],是許多病原菌毒力的重要特征[34]。細菌的趨化性在病原菌定殖和侵染過程中起著不可或缺的作用,而鞭毛運動加強了侵染過程,缺乏趨化相關(guān)基因的菌株侵染能力下降[5]。相關(guān)研究表明,植物青枯菌在侵染番茄的初期,細菌與寄主植物番茄的相互識別及在寄主植物內(nèi)定殖和菌株的趨化能力密切相關(guān),失去趨化能力的菌株,致病力顯著降低[6]。細菌趨化性與細菌在寄主植物表面的定殖關(guān)系密切,趨化核心基因的缺失導致細菌無法定殖,侵染能力嚴重下降[7]。由此可見,細菌的趨化性在病原菌的致病過程中起著至關(guān)重要的作用。

目前對西瓜嗜酸菌趨化性的研究報道甚少,西瓜嗜酸菌是否具有趨化性,趨化性與侵染能力是否有直接的關(guān)系,均有待研究。為此,本文采用毛細管法對西瓜嗜酸菌Ac-5進行了趨化性檢測,以期為防治瓜類細菌性果斑病提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1菌種

西瓜嗜酸菌Ac-5菌株分離自臺灣西瓜,由植物病蟲害國家重點實驗室蔬菜病害研究組保存。

1.2培養(yǎng)基及試劑

KB培養(yǎng)基:蛋白胨20g,瓊脂 15g,K2HPO41.5g,MgSO4·7H2O1.5g,甘油15.0mL,加去離子水至1L,pH=7.0,121℃滅菌20min。

無機培養(yǎng)基:磷酸氫二鈉 3g,磷酸二氫鉀1g,硫酸銨5g,氯化鎂0.02g,氯化鈣0.02g,對氨基苯甲酸0.001 5g,加去離子水至1L,pH=7.0,121℃滅菌20min。

趨化緩沖液:磷酸氫二鉀2.282 2g,EDTA0.033 8g,硫酸鎂0.120 4g,加去離子水至1L,pH=7.0,121℃滅菌20min。

氨芐青霉素(Amp)：50mg/mL。

碳源:乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、半乳糖;20種氨基酸:L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺;有機酸:蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、半乳糖醛酸、乙酸;其他物質(zhì):氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、酵母粉。其中L-酪氨酸、蘋果酸、半乳糖醛酸、琥珀酸和氨芐抗生素購自北京冰達生物科技有限公司,其他試劑均購自北京化工有限公司。

1.3趨化待測液的制備

用無機培養(yǎng)基配制2g/L的蔗糖溶液,用0.22μm過濾器過濾除菌,之后用無機培養(yǎng)基將其稀釋為0.2g/L。其他碳源、氨基酸及有機酸的配制方法同蔗糖趨化待測液,碳源和氨基酸終濃度為0.2g/L,有機酸的終濃度為0.1g/L。

1.4菌液的制備

取4℃保存的西瓜嗜酸菌Ac-5菌株,用20μL小槍頭蘸取單菌落轉(zhuǎn)移到液體KB培養(yǎng)基中,于28℃振蕩培養(yǎng)10h左右,28℃ 4 000r/min離心10min得到菌體,用趨化緩沖液清洗3次,調(diào)A600=0.1。

1.5趨化反應試驗

采用毛細管法(圖1)測定西瓜嗜酸菌的趨化性影響因素[8]。分別以不同碳源、20種常見氨基酸、不同有機酸和其他物質(zhì)制備含0.2g/L不同趨化物質(zhì)的趨化待測液(有機酸含量為0.1g/L),對照為不加任何趨化劑的趨化待測液。玻璃毛細管(內(nèi)徑0.3mm)一端吸入5μL趨化待測液,另一端用口香糖封閉,然后插入加了400μLA600=0.1的西瓜嗜酸菌菌液的1mL去頭注射器中。28℃水平孵育1h,取出用無菌水清洗表面,折斷毛細管,將趨化待測液吹入1.5mL離心管中,加入1mL滅菌去離子水,之后取100μL涂在含50mg/mLAmp的KB平板上,40h后用全自動菌落計數(shù)分析儀進行平板菌落計數(shù)。

圖1　毛細管法示意圖Fig.1　Capillary method

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗中每處理均設3組重復,結(jié)果以平均值及標準誤表示,試驗數(shù)據(jù)采用Excel2007軟件進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同碳源對西瓜嗜酸菌趨化性的影響

與不含碳源的趨化待測液對照組相比，趨化待測液中加入麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖或半乳糖后，毛細管中的西瓜嗜酸菌數(shù)量顯著增多；半乳糖處理下嗜酸菌數(shù)量顯著高于麥芽糖、葡萄糖和乳糖，而與蔗糖差異不顯著(P<0.05)(圖2)。碳源對細菌趨化作用的影響，一方面可能是由于糖代謝影響能量的供應，最終對趨化信號分子的傳導產(chǎn)生影響，另一方面可能是由于西瓜嗜酸菌本身對這5種碳源有較強的趨化性所致[8]。

2.220種常見氨基酸對西瓜嗜酸菌趨化性的影響

圖3顯示，L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸試驗組毛細管中的西瓜嗜酸菌數(shù)量顯著多于不加任何氨基酸的趨化待測液對照組；L-谷氨酰胺處理下西瓜嗜酸菌的數(shù)量顯著高于L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-丙氨酸，與L-纈氨酸差異不顯著。其中L-谷氨酰胺和L-谷氨酸的增加有助于趨化信號轉(zhuǎn)導途徑中甲基化水平[9]。

圖2　碳源對玻璃毛細管中細菌數(shù)的影響Fig.2　Influence of different carbon resources on bacterial numbers in capillary

圖3　不同氨基酸對玻璃毛細管中細菌數(shù)的影響Fig.3　Influence of different amino acids on bacterial numbers in capillary

2.3不同有機酸對西瓜嗜酸菌趨化性的影響

圖4為不同有機酸對西瓜嗜酸菌趨化性的影響。琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸試驗組毛細管中的西瓜嗜酸菌的數(shù)量顯著多于不加任何有機酸的趨化待測液對照組；檸檬酸和蘋果酸處理下西瓜嗜酸菌的數(shù)量與不加任何有機酸的趨化待測液對照組相比要高，但是差異不顯著，琥珀酸和半乳糖醛酸處理下西瓜嗜酸菌的數(shù)量與酒石酸處理差異不顯著。研究表明油菜根系分泌物中含有大量的琥珀酸[10]。從黃瓜根際分離的拮抗菌SQR9對蘋果酸和檸檬酸有較強的趨化性。檸檬酸顯著誘導SQR9生物膜的形成，促進其在寄主根際的定殖[11]。這可能是由于檸檬酸和蘋果酸是三羧酸循環(huán)中的重要的中間產(chǎn)物，對糖類的分解有顯著的促進作用，從而為鞭毛的運動提供了動力。

圖4　不同有機酸對玻璃毛細管中細菌數(shù)量的影響Fig.4　Influence of different organic acids on bacterial number in capillary

2.4其他物質(zhì)對西瓜嗜酸菌趨化性的影響

圖5為其他物質(zhì)對西瓜嗜酸菌趨化性的影響。所測物質(zhì)對西瓜嗜酸菌的趨化性均沒有顯著影響(P>0.05)。相對而言，磷酸氫二鉀試驗組毛細管中的西瓜嗜酸菌數(shù)量稍多于其他試驗組及對照組。

圖5　其他物質(zhì)對玻璃毛細管中細菌數(shù)量的影響Fig.5　Influence of other substance on bacterial number in capillary

3　討論

目前國內(nèi)外研究細菌趨化性的方法主要有:游動平板法、瓊脂塊法、毛細管法、數(shù)量分析法等,游動平板法需用到基本培養(yǎng)基,然而西瓜嗜酸菌在基本培養(yǎng)基上生長欠佳,所以本試驗選用比較常用的毛細管法,并結(jié)合平板菌落計數(shù)法對西瓜嗜酸菌進行計數(shù)[8]。

本研究采用毛細管法研究了不同碳源、氨基酸、有機酸及其他物質(zhì)對西瓜嗜酸菌Ac-5菌株趨化性的影響,初步了解西瓜嗜酸菌Ac-5菌株趨化性。半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、半乳糖醛酸及琥珀酸對西瓜嗜酸菌的趨化性有顯著的促進作用。

西瓜嗜酸菌Ac-5菌株的趨化性差異是由不同物質(zhì)及環(huán)境條件對趨化性的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)產(chǎn)生不同影響造成的。比如溫度可以影響酶的活性,在趨化信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中組氨酸激酶在磷酸化/去磷酸化過程中起著關(guān)鍵的作用[1213],影響趨化信號的傳遞;L-亮氨酸與亮氨酸拉鏈形成有關(guān),在植物中多個亮氨酸拉鏈組成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域是亮氨酸拉鏈在抗性反應中發(fā)揮作用的主要形式,能夠促進蛋白質(zhì)的相互作用,主要功能是協(xié)助完成寄主病原物的識別及抗性反應信號的傳導[14];檸檬酸顯著誘導生物膜的形成,促進其在寄主根際的定殖[10];碳源、酵母粉等通過影響新陳代謝,對趨化信號分子的傳導產(chǎn)生影響,同時分解代謝產(chǎn)生的能量可為鞭毛的運動提供動力;L-谷氨酰胺和L-谷氨酸的增加有助于趨化信號轉(zhuǎn)導途徑中甲基化水平[9],從而影響趨化轉(zhuǎn)導過程。

西瓜嗜酸菌趨化性的信號轉(zhuǎn)導機制及關(guān)鍵調(diào)控基因有待進一步研究,從而揭示趨化基因與西瓜嗜酸菌Ac-5菌株趨化性的關(guān)系。我們將進一步研究信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)和趨化性之間的關(guān)系,進而研究趨化性和致病性之間的復雜關(guān)系,從而創(chuàng)造對西瓜甜瓜有利的生活環(huán)境,減少瓜類細菌性果斑病對西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成的損失。

[1]SchaadNW,PostnikovaE,SechlerA,etal.ReclassificationofsubspeciesofAcidovorax avenaeasA.avenae (Manns1905)emend., A.cattleyae (Pavarino,1911)comb.nov., A.citrulliSchaadetal,1978)comb.nov.,andproposalofA.oryzaesp.nov.[J].SystematicandAppliedMicrobiology,2008,31:434446.

[2]AdlerJ.AmethodformeasuringchemotaxisanduseofthemethodtodetermineoptimumconditionsforchemotaxisbyEscherichia coli [J].JournalofGeneralMicrobiology, 1973, 74(1):7791.

[3]FreterR.Mechanismsofassociationofbacteriawithmucosalsurfaces[J].CibaFoundationSymposium,1981,80:3655.

[4]FreterR,O’BrienPC.Roleofchemotaxisintheassociationofmotilebacteriawithintestinalmucosa:chemotacticresponsesofVibrio choleraeanddescriptionofmotilenonchemotacticmutants[J].InfectionandImmunity, 1981, 34(1):215221.

[5]LovellMA,BarrowPA.IntestinalcolonisationofgnotobioticpigsbySalmonellaorganisms:interactionbetweenisogenicandunrelatedstrains[J].JournalofMedicalMicrobiology, 1999, 48(10):907916.

[6]Tans-KerstenJ,HuangH,AllenC. Ralstonia solanacearumneedsmotilityforinvasivevirulenceontomato[J].JournalofBacteriology, 2001, 183(12):35973605.

[7]JonesBD,LeeCA,FalkowS.InvasionbySalmonella typhimuriumisaffectedbythedirectionofflagellarrotation[J].InfectionandImmunity, 1992, 60(6):24752480.

[8]鄒文政, 紀榮興, 義家波, 等. 河流弧菌對牙鲆表皮粘液的趨化作用[J]. 水產(chǎn)學報, 2009(2):318325.

[9]WadhamsGH,ArmitageJP.Makingsenseofitall:bacterialchemotaxis[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2004,5(12):10241037.

[10]胡小加,謝立華,余常兵,等.巨大芽孢桿菌A6對油菜根系分泌物所含有機酸和糖類的趨化性[J].中國油料作物學報,2011,33(4):416419.

[11]張楠. 根際有益芽孢桿菌N11及SQR9與植物根系的互作研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學, 2012.

[12]HessJF,OosawaK,KaplanN,etal.Phosphorylationofthreeproteinsinthesignalingpathwayofbacterialchemotaxis[J].Cell,1988,53:7987.

[13]BorkovichKA,KaplanN,HessJF,etal.Transmembranesignaltransductioninbacterialchemotaxisinvolvesligand-dependentactivationofphosphategrouptransfer[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesAmerica,1989,86(4):12081212.

[14]馬媛媛, 甘睿, 王寧寧. 植物富含亮氨酸重復序列型類受體蛋白激酶的生物學功能[J]. 植物生理與分子生物學學報, 2005, 31(4):331339.

(責任編輯：楊明麗)

PreliminarystudyonthechemotaxisofAcidovorax citrulli

YangShanshan,SunBaixin,WangTielin,ZhangXiaoxiao,YangYuwen,ZhaoTingchang

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Bacterialfruitblotch(BFB)isaworldwidequarantinedisease,causedbyAcidovorax citrulli,andseedscarryingbacteriaarethemainsourceofinfection.Thecolonizationofpathogenicbacteriainhostsishighlyrelatedtovirulence,andchemotaxisisakeyfactortothecolonizationofA. citrulli.StudyingtheeffectofdifferentsubstancesonthechemotaxisofA. citrulliplayedagreatroleinpreventingBFB.Inthisstudy,capillarymethodwasusedtodeterminetheeffectsofcarbon,aminoacids,andorganicacidsonthechemotaxisofA. citrulli.Theresultsshowedthat,amongthecarbonresources,maltose,glucose,lactose,sucrose,andgalactosesignificantlypromotedthechemotaxisofA.citrulli;amongtheaminoacids,L-arginine,L-asparticacid,L-histidine,L-glutamicacid,L-leucine,L-valine,L-glutamineandL-alaninesignificantlypromoteditschemotaxis;amongtheorganicacids,succinicacid,galacturonicacidandtartaricacidsignificantlypromotedchemotaxisofA.citrulli;othersubstancessuchasNaClandMgSO4hadnosignificanteffectonitschemotaxis.

Acidovorax citrulli;chemotaxis;capillarymethod

20150416

20150512

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003066)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-26)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目

E-mail:zhaotingchang@caas.cn

S436.5

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.028