北京地區辣椒上黃瓜花葉病毒和甜菜西方黃化病毒復合侵染的分子鑒定

左琳彧,　雍容婧,　袁　雯,　杜開通,　周　濤

(中國農業大學植物病理學系,北京　100193)

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北京地區辣椒上黃瓜花葉病毒和甜菜西方黃化病毒復合侵染的分子鑒定

左琳彧#,雍容婧#,袁雯,杜開通,周濤*

(中國農業大學植物病理學系,北京100193)

辣椒是我國重要的蔬菜和經濟作物,受多種病毒危害。2014年在北京市順義區調查時發現部分種植的辣椒植株上葉片大面積黃化,邊緣癥狀明顯,個別植株葉片輕微上卷。提取典型癥狀樣品的總RNA,反轉錄得到cDNA,分別用黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特異引物和馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)通用引物進行PCR檢測,CMV特異引物和馬鈴薯卷葉病毒屬通用引物分別擴增得到約650bp和1 400bp的特異條帶。測序和核苷酸序列比對表明,其分別與CMV和甜菜西方黃化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高為99%和96%。這是對我國種植的辣椒上發生的CMV和BWYV復合侵染的首次報道。

蚜傳病毒;黃瓜花葉病毒;甜菜西方黃化病毒;復合侵染;RT-PCR

辣椒(Capsicum annuumLinn.)屬茄科,為一年生或有限多年生草本植物,是世界上廣泛種植的蔬菜之一,尤其在我國居民的日常飲食中扮演著重要的角色。辣椒病毒病是我國辣椒生產中的主要病害之一,常造成花葉、黃化、畸形等癥狀,對辣椒產量造成嚴重影響。據報道,至少有45種病毒可侵染辣椒,以煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)發生最為普遍,馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)、番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)、苜?；ㄈ~病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)、煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)等也是常見的侵染辣椒的病毒[16]。2014年夏我們在對河北唐山辣椒病毒病進行調查和檢測過程中,首次檢測到了甜菜西方黃化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)[7]。

黃瓜花葉病毒(CMV)是危害辣椒的主要病毒之一,主要通過蚜蟲傳播,引起辣椒系統花葉、皺縮和矮化,導致果實畸形,嚴重減產[8]。我國長江流域辣椒種植區受害最重,一般年份可造成減產20%～30%,嚴重時損失可達50%～60%,個別地區甚至絕收[9]。在所有侵染辣椒的病毒中,CMV檢出率最高,是辣椒抗病育種的主攻目標[10]。BWYV屬于馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus),危害世界許多地區的甜菜生產,是我國甜菜黃化病的致病因子之一,在內蒙古和甘肅的甜菜產區均有發生。自然界中,BWYV主要通過蚜蟲以持久循回非增殖方式傳播,主要危害藜科植物如甜菜等,還危害十字花科、茄科、葫蘆科、豆科、馬齒莧科植物[11]。

2014年秋,在北京市順義地區對蔬菜常見病害進行調查時,在大田露地種植的辣椒上發現葉片出現明顯的黃化癥狀,有些植株葉片大部分黃化,邊緣癥狀明顯;個別植株葉片輕微上卷。作者采集具有典型發病癥狀的辣椒樣品,提取葉片總RNA后進行反轉錄,利用特異引物或通用引物進行PCR檢測,并經序列測定和比對分析,對其病原進行了鑒定,現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1樣品采集

2014年6月在北京順義楊鎮中國農業科學院蔬菜花卉研究所基地大田中采集表現典型葉片黃化,葉脈間組織失綠并帶有褐色小斑的辣椒葉片,整理后取一部分用于總RNA的提取。

1.2葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取辣椒葉片總RNA。取癥狀典型的葉片于液氮中研磨,將0.1g粉末轉入1.5mL離心管中,迅速加入1mLTRIzol試劑,振蕩混勻,室溫靜置5min后,4℃下12 000r/min離心10min。將上清液轉入1.5mL離心管,加入0.2mL氯仿混勻,室溫放置5min后,4℃下12 000r/min離心10min,取上清液540μL至1.5mL離心管,加入等體積異丙醇并混勻。室溫放置30min。4℃下12 000r/min離心10min,用75%乙醇洗滌沉淀。最后用無核酶的去離子水溶解。

1.3反轉錄PCR和序列測定

在RNA專用離心管中加入總RNA2μg、10μmol/Lrandomprimer0.5μL和10mmol/LdNTPs0.5μL,用無核酶的超純水補充體積至25μL;混勻后于離心機中短暫離心,放入65℃金屬浴中變性5min; 冰浴3min后,依次向管中加入5×M-MLVbuffer5μL、RibonucleaseInhibitor0.5μL、M-MLV反轉錄酶1.0μL,混勻后短暫離心; 42℃水浴1h。

將反轉錄得到的cDNA分別用CMV特異檢測引物CMVCPf(5′-ATGGACAAATCTGAATCAACAA-3′)、CMVCPr(5′-TCAGACTGGGAGCACCCCAGACGT-3′)[12],以及Polerovirus屬通用檢測引物PoconF(5′-GAYTGYTCYGGTTTTGACTGG-3′)、PocoCPR(5′-CGTCTACCTATTTSGGRTTN-3′)[13]進行PCR,擴增CMV外殼蛋白的部分保守序列以及BWYV中編碼ORF2和ORF3之間的部分保守序列。20μL的PCR反應體系如下:cDNA1μL、10mmol/LdNTPs1μL、10mmol/L上游引物和下游引物各1μL、10×反應緩沖液2μL、5U/μLTaqDNA聚合酶 0.25μL,ddH2O13.8μL。PCR反應條件為:95℃變性3min;按下列條件進行35個循環:95℃變性30s,55℃復性45s,72℃延伸2min;循環結束后在72℃延伸10min。全部PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。PCR產物送至華大基因公司進行測序獲得序列。

1.4序列比對分析

利用NCBI序列比對工具BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序nucleotideblast比對分析克隆獲得的序列,根據同源性確定病毒種類。

2　結果與分析

2.1樣品檢測

以反轉錄得到的cDNA為模板,利用CMV特異引物(CMVCPf和CMVCPr)和Polerovirus通用檢測引物(PoconF和PococpR)進行PCR,得到約650bp和1 410bp的片段(圖1),與CMV和Polerovirus檢測引物的目標片段長度相符,表明采集的辣椒樣品可能被CMV和Polerovirus屬的病毒復合侵染危害。

圖1　利用RT-PCR檢測辣椒樣品的BWYV和CMV Fig.1　Detection of BWYV and CMV on pepper samples using RT-PCR

2.2CMV和BWYV北京分離物部分序列分析

將2.1獲得的PCR產物切膠回收純化后,利用檢測引物進行目標片段序列測定,獲得的有效序列大小分別為620bp和1 240bp。經BLAST程序中的nucleotideblast進行序列同源性檢索和分析,結果表明,經RT-PCR檢測為CMV和BWYV的陽性辣椒樣品,其擴增序列分別與GenBank中報道的CMV和BWYV序列有很高的同源性。其中,長度為620bp的序列與登錄號為EF088683.1、EF424784.1、AY600989.1、EF424782.1、EF424778.1、AF127977.1、KJ467817.1、EF122499.1的部分序列均有99%的同源性;長度為1 240bp的序列與韓國的BWYV分離物序列(KM076647.1)同源性最高,同源性高達96%,與BWYV北京分離物HM804471.1 和HM804472.1的同源性分別為94%和93%;與BWYV美國分離物AF473561.1的同源性為90%。以上序列分析結果表明,在北京順義采集的辣椒樣品被CMV和BWYV復合感染。

3　討論

通過對在北京市順義區采集的表現病毒病癥狀的辣椒樣品進行RNA提取、RT-PCR、測序和分析,經在NCBI上進行BLAST序列比對,結果表明辣椒樣品被CMV和BWYV復合侵染,這是在我國首次發現CMV和BWYV復合侵染辣椒。CMV是我國辣椒上發生的一種常見病毒,而BWYV目前僅在我國河北的辣椒上發生,是我國辣椒上發生的一種新病毒[7]。鑒于辣椒的重要性和辣椒上發生病毒的多樣性,有必要對BWYV在我國辣椒上的發生、危害情況等進行詳細調查研究,便于盡早制定有效的防治策略和措施,減少生產損失。

CMV和BWYV的自然傳播介體均是蚜蟲。蚜蟲種類多,分布廣,繁殖能力強,是傳播植物病毒病的主要介體。許多蚜蟲種類有長距離遷飛的行為,遷飛多發生在晴朗的白天, 溫度、光照和風是影響遷飛的主要因素,條件適合時,蚜蟲可上升到逆溫層并隨氣流遷飛到上百公里以外的地方[14]。這些特點使蚜傳病毒病的發生具有突發性,且一旦發生危害嚴重。

病毒病是辣椒上的常見病害,且多種病毒復合侵染時有發生,田間癥狀復雜,對生產危害大。實際生產中,為降低病毒病的發生和危害,應在選擇抗病毒品種的基礎上,加強對傳毒介體(如蚜蟲等)的監測和控制,發現傳毒介體大發生時,及時采取化學和物理等防治措施進行有效防治。

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(責任編輯：楊明麗)

Molecularidentificationofco-infectionofCucumber mosaic virusandBeet western yellows virusonpepperinBeijing

ZuoLinyu,YongRongjing,YuanWen,DuKaitong,ZhouTao

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

Pepper,animportantvegetableandeconomiccrop,issusceptibletomanyviruses.Inasurveyofvirusdiseasesonvegetablesin2014,somepepperplantsshowingtypicalyellowleafsymptomwerefoundinShunyiDistrict,Beijing,China.TotalRNAwasisolatedfromthesamplewithtypicalsymptom,andreversetranscript-PCRassayswereperformedwithspecificprimersforCucumber mosaic virus (CMV)anddegenerateprimersforPolerovirus.TwospecificDNAfragments,oneabout650bpandanother1 400bp,wereobtainedusingprimersforCMVandPolerovirus,respectively.Nucleotidesequenceanalysisshowedthattheyhadthehighestidentityof99%and96%withthatofCMVandBeet western yellows virus (BWYV),separately.Toourknowledge,thisisthefirstreportofco-infectionofCMVandBWYVonpepperplants.

aphid-bornevirus;Cucumber mosaic virus;Beet western yellows virus;co-infection;RT-PCR

20150523

20150723

公益性行業(農業)科研專項(201303028)；國家大學生科技創新項目

E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn

S436.418.12

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.033

#為并列第一作者