加工工藝對苦茶槭有效成分和抗氧化活性的影響*

孔成誠,方成武,張傳標,張明燕

(1 安徽中醫藥大學藥學院，安徽　合肥　230031; 2 安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽　亳州　236000;3 安徽省第二人民醫院藥劑科，安徽　合肥　230031)

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加工工藝對苦茶槭有效成分和抗氧化活性的影響*

孔成誠1,方成武2,張傳標3,張明燕1

(1 安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥230031; 2 安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽亳州236000;3 安徽省第二人民醫院藥劑科，安徽合肥230031)

研究了不同加工工藝對苦茶槭主要活性成分和抗氧化活性的影響，以期篩選最適合苦茶槭加工方式。對所采集的苦茶槭鮮葉以不同加工方式進行加工處理，采取HPLC法對苦茶槭主要有效成分沒食子酸含量進行檢測。采用DPPH法評價不同加工方法苦茶槭自由基的抗氧化活動。結果顯示，采用紅茶加工法的苦茶槭沒食子酸含量為(18.49±1.13) mg/g高于綠茶加工法(12.45±1.92) mg/g和自然陰干法(14.28±1.13) mg/g。不同加工方法的苦茶槭IC50依次為：綠茶工藝(0.443 mg/mL)<自然陰干(0.726 mg/mL)<紅茶工藝(1.286 mg/mL)。從提高苦茶槭沒食子酸含量，增加抗氧化活性角度建議采用紅茶加工方法。

苦茶槭； 沒食子酸； DPPH； 抗氧化活性

苦茶槭(Acer.Ginnala.Maxim),植物界被子植物亞門(Angiosperms)雙子葉植物綱，槭樹科，槭屬，落葉小喬木或灌木，重要的藥食兼用的野生藥用植物。《中華本草》記載將其幼嫩的葉、芽入藥，用開水沖泡化茶飲，清肝明目。主風熱頭痛、肝熱止赤、視物昏花。

苦茶槭干葉中可提取沒食子酸100 g/kg，沒食子酸具有抗氧化、抗炎、抗突變等功效[1]，目前苦茶槭是生產天然沒食子酸的重要原料，從這點看，沒食子酸是苦茶槭的重要生理活性成分[2]。

目前，苦茶槭的加工工藝是仿照傳統綠茶的制茶工藝，并未見報道采用紅茶加工方法或傳統葉類中藥材加工方法，紅茶味甘性溫，暖胃護胃，更適合老年人飲用，葉類中藥加工方法簡單。不同的加工方法對苦茶槭中沒食子酸含量和抗氧化活性是否產生影響？

本文將苦茶槭分別采用綠茶、紅茶以及陰干法三種方法加工。應用HPLC法和DPPH法對苦茶槭進行分析，分別探討不同加工方法對其沒食子酸含量和抗氧化性的影響。

1　實　驗

1.1儀器

Agilent 1100液相色譜儀；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XS-105型電子天平，梅特勒-托利多；PURELAB Ultra超純水器；HH教顯恒溫水浴鍋，江蘇國勝實驗儀器廠；RE-52B型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器；LC-4012離心機，安徽中科中佳科學儀器公司；FD115干燥箱，Binder。

1.2試劑和藥品

沒食子酸對照品，中國食品藥品生物制品檢定所(批號：110831-201204)。1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基，Sigma公司；甲醇為國產色譜純、抗壞血酸為國產分析純；水為超純水。

苦茶槭樣品于2013年4月，采自舒城萬佛山(林緣，海拔400～510 m)。由安徽中醫藥大學方成武教授鑒定為槭樹科槭屬植物苦茶槭。

1.3不同加工工藝苦茶槭樣品的制備

將采摘鮮葉分別稱取在安徽農業大學教學實驗茶場分別按綠茶、紅茶、葉類中藥的傳統加工工藝加工。具體工序如下[3]:

綠茶法：滾筒殺青→揉捻機揉捻→炭火烘籠干燥

紅茶法：萎凋→揉捻機揉捻→發酵→炭火烘籠干燥，其中萎凋采用萎凋槽萎凋法，發酵時葉溫以保持在30～32 ℃，室溫控制在24～25 ℃，發酵時間為18 h。

陰干法：在室內較通氣的地方攤薄，勤翻動。

1.4不同加工工藝苦茶槭沒食子酸含量HPLC法

1.4.1供試品溶液的制備

稱取1.00 g，加入100 mL沸水，超聲處理(功率360 W，頻率50 kHz)30 min，100 ℃水浴30 min，過濾，冷卻后定容至 100 mL，超聲處理(功率360 W，頻率50 kHz)30 min，高速離心(8000 r/min，10 min)后取上層清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液為供試品溶液。

1.4.2對照品溶液

取五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的沒食子酸對照品，精密稱定25 mg，置50 mL容量瓶，加超純水溶解并稀釋至刻度，超聲15 min，制成濃度為0.5 mg/mL沒食子酸溶液。

1.4.3色譜條件

色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸(5:95)，掃描波長：200～400 nm，檢測波長為272 nm，柱溫：30 ℃。流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL。

1.4.4線性關系考察

取對照品溶液適量，分別稀釋得到0.2、0.1、0.05、0.02 mg/mL 沒食子酸溶液。在上述色譜條件下平行測定，分別以對照品溶液濃度為縱坐標(X)，峰面積為橫坐標Y，得到標準曲線：y=0.0013x-0.0103；R=0.9994。結果表明，在0.02～0.2 mg/mL的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

1.5苦茶槭抗氧化活性DPPH法[5]

1.5.1樣品溶液制備

稱取不同加工方法制備的苦茶槭樣品5 g，加100 ℃蒸餾水100 mL沖泡10min，過濾取茶湯，冷卻后1500 r/min離心10 min 取上清液。濾渣用同法再沖泡1次，兩次茶湯合并，定容至200 mL。

1.5.2DPPH標準溶液制備

準確稱取25.1 mg DPPH用95%乙醇溶解并定容至100 mL 容量瓶中，超聲15 min，即得濃度為251.0 mg/L的DPPH母液，避光4 ℃保存備用。臨用時再稀釋配制濃度為30 mg/L的DPPH標準溶液。

1.5.3DPPH自由基清除率的測定

取分別稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的濃度梯度的待測樣液2 mL，加入30 mg/L的DPPH溶液2 mL，輕輕振蕩，使其混合均勻，避光30 min待藥物與自由基完全反應，于4500 r/min離心15 min取上清液，517 nm[15-16]處測量吸光度Ai。用2 mL 95%乙醇+2 mL DPPH做空白對照，數值為A0。樣品組用2 mL的95%乙醇+2.0 mL樣品，消除樣品本身顏色的影響，數值為Aj。每個濃度平行測定三次，取其平均值。按公式計算各樣品對DPPH的清除率。

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2　結果與討論

2.1不同加工工藝苦茶槭沒食子酸含量檢測結果

對相同原料來源、相同儲存時間、不同加工工藝的苦茶槭為研究對象，采用高效液相色譜法比較不同加工工藝的苦茶槭在沒食子酸含量上的差異。以期得到具有較高活性成分沒食子酸的保健茶。經三次檢測得出結果列于表1中。

表1　不同加工工藝苦茶槭沒食子酸的HPLC含量

應用 SPSS17.0 統計學軟件對表1中的數據進行比較分析。紅茶工藝法制得的樣品沒食子酸含量比綠茶工藝法和陰干法差異顯著(P<0.05)，含量最高，具有統計學意義；綠茶工藝法制得的樣品沒食子酸含量比陰干法含量高，差異顯著(P<0.05)，具有統計學意義。所以通過對三種方法的統計學分析，可以看出紅茶工藝法制得的沒食子酸含量最高，陰干法含量最低。

2.2不同加工工藝苦茶槭沒食子酸含量檢測結果

對不同加工工藝的苦茶槭按照自由基清除率的測試方法進行測定，以清除率為縱坐標，樣品溶液質量濃度為橫坐標，繪制清除率曲線，在一定質量濃度范圍內，DPPH的清除率(y)與不同加工工藝苦茶槭的質量濃度(x)呈線性關系，以IC50為標準比較其抗氧化性強弱。

表2　不同加工工藝苦茶槭清除DPPH自由基的IC50值

從表2看出不同加工方法的苦茶槭都具有較強的清除自由基活性，相比較而言采用紅茶加工方法的苦茶槭清除自由基作用是綠茶的近3倍，是陰干法的近1.8倍，明顯優于其他兩種方法。

結合表1和表2可以看出，不同加工工藝的苦茶槭抗氧化性與沒食子酸含量呈正相關性。

3　結　論

目前，苦茶槭的加工工藝是仿照傳統綠茶的制茶工藝，相

比較紅茶加工法和葉類中藥加工法，其沒食子酸含量和抗氧化活性均明顯下降。這可能與綠茶制法中的殺青環節中溫度達到200～250 ℃有關。雖然采用綠茶制法可以保持苦茶槭清湯綠葉的品質，但是做為一種藥食兼用的藥用植物，綠茶制法對沒食子酸含量和抗氧化性均產生了影響，綠茶制法并不有利于其藥效表達。因此從藥效作用來講，可以采用傳統葉類中藥材加工方法或紅茶加工法。如果受條件限制，采用傳統葉類中藥材加工方法即可。

研究發現，微生物能夠有效的降解水解單寧，促進沒食子酸的生成[4]。本研究中，采用紅茶加工方法的苦茶槭中沒食子酸含量和抗氧化活性均優于其他兩種方法。這可能與紅茶加工過程中，因為發酵作用導致微生物降解了部分水解單寧生成沒食子酸，和酶促氧化作用[6]導致紅茶的沒食子酸含量和抗氧化作用均由于綠茶法和陰干法。而綠茶加工過程中，快速殺青是的溫度會達到200～250 ℃，高溫會抑制酶活性，抑制苦茶槭內的化學成分之間發生酶促反應，該因素也可能導致綠茶中的沒食子酸含量最少的原因。

試驗結果表明，苦茶槭DPPH自由基清除能力與沒食子酸含量呈正相關性，結果顯示苦茶槭的抗氧化能力可能與沒食子酸的含量具有一定相關性。但是不同苦茶槭的沒食子酸差異性不大，而DPPH自由基清除率卻呈現出較大差異。暗示著采用不同的加工工藝的苦茶槭， 除沒食子酸以外可能生成了新的抗氧化性物質，具體是哪些抗氧化性成分有待今后進一步研究。

[1]郭炳瑩,阮宇成,程啟坤.沒食子酸與綠茶品質的關系[J]. 茶葉科學,1990, 10(1):41-43.

[2]李海艷,詹亞光.茶條槭及其次生代謝產物沒食子酸的研究進展[J].生物技術通報,2007(6):59-61.

[3]陳雪.不同類型茶葉抗氧化功能的比較研究[D].長沙:湖南農業大學,2012:4-6.

[4]孫達旺.植物單寧化學[M].北京:中國林業出版社,1992.89-92.

[5]Sharm A O P, BHAT T K. DPPH antioxidant assay revisited[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4):1202-1205.

[6]郭魯宏,楊順楷.利用固定化黑曲霉單寧酶制備沒食子酸的研究[J].生物工程學報, 2000,16(5):614-617.

Effect of Different Processing Technology ofAcer.Ginnala.Maximon the Active Ingredients and Antioxidant Activity*

KONGCheng-cheng1,FANGCheng-wu2,ZHANGChuan-biao3,ZHANGMing-yan1

(1 College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230031;2 Institute of Bozhou Chinese Medica, Anhui Acadenmy of Chinese Medicine, Anhui Bozhou 236000;3 Department of Pharmacy, Anhui NO.2 Province People’s Hospital, Anhui Hefei 230031, China)

To study on the effects of different processing method of Acer. Ginnala. Maxim main active ingredient and antioxidant activity, used Acer Ginnala Maxim as raw material in different processing methods, HPLC method was used to measure main active ingredient content of gallic acid. DPPH method was used to determine the scavenging effect on free radicals. Result showed that Acer. Ginnala. Maxim processing method of Black tea, gallic acid content was (18.49±1.13) mg/g, higher than processing method of green tea of (12.45±1.92) mg/g and dried in shade of (14.28±1.13) mg/g. Antioxidant activity of the different processing methods of Acer. Ginnala. Maxim was in the following order: the method of green tea(0.443 mg/mL)< the method of dried in shade(0.726 mg/mL)< the method of black tea(1.286 mg/mL). From the angle of improve the content of Gallic acid and increased the antioxidant activity, the processing method of black tea was much better.

Acer. Ginnala. Maxim; Gallic acid; DPPH; antioxidant activity

安徽中醫藥大學校級自然青年基金(2013qn007)。

方成武。

R94

A

1001-9677(2016)010-0084-03