高效液相色譜法測定萹蓄中綠原酸含量*

鄧仕任，朱夏敏，王　鑫，王春嬌，夏林波

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧　大連　116600)

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分析測試

高效液相色譜法測定萹蓄中綠原酸含量*

鄧仕任，朱夏敏，王鑫，王春嬌，夏林波

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600)

建立了高效液相色譜測定萹蓄藥材中綠原酸含量的方法，為萹蓄的合理質量控制提供依據。用伊力特Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μM)，流動相乙腈-水(12:88，V:V)，檢測波長325 nm。結果顯示綠原酸在0.125～1.25 mg/mL范圍內線性關系良好，r=0.9995(n=6)，加樣回收率101.0%，RSD=1.62%(n=6)；3批萹蓄藥材中綠原酸的含量為0.11～0.19 mg/g。綠原酸為萹蓄藥材中的特征活性成分，所建立的含測方法操作簡便，結果可靠，可作為萹蓄藥材質量控制的指標性成分之一。

萹蓄；綠原酸；高效液相色譜；含量測定

萹蓄為蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，始載于《神農本草經》，味苦、性微寒，歸膀胱經，具有利尿通淋，殺蟲止癢的功效，常用于熱淋澀痛，小便赤短，蟲積腹痛，皮膚濕疹等癥[1]，是一味常用中草藥。現代研究表明，萹蓄具有利尿、降壓、止血、抑菌、抗氧化和保肝等藥理作用，臨床上用于治療泌尿系統疾病、腸道系統疾病及糖尿病等[2]。我們的前期研究表明，萹蓄的乙醇提物對α-葡萄糖苷酶具有較好的體外抑制活性，這可能是其治療糖尿病的作用機制之一。萹蓄的主要化學成分有黃酮類、酚酸類、苯丙素類、生物堿類、萜類等[3]。目前，對萹蓄的質量控制研究主要集中在黃酮類化合物中[4-5]，尚未見基于酚酸類成分展開的質量控制研究。綠原酸為萹蓄中的特征酚酸類成分，其具有降壓、抗菌、保肝、抗病毒、抗氧化等多方面藥理活性[6-7]，為萹蓄的藥效活性成分之一。本實驗擬以綠原酸為指標成分，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，建立萹蓄藥材中綠原酸的HPLC分析方法，以期為萹蓄藥材的合理質量控制提供相關科學依據。

1　實驗儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫；METTLER AE-240型十萬分之一分析天，瑞士梅特勒；FA1004B電子天平，上海精密科學儀器有限公司；KQ-250DB型數控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

綠原酸對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)，天津市大茂化學試劑廠；水為娃哈哈純凈水。

3批萹蓄藥材采集自遼寧鞍山千山地區，經遼寧中醫藥大學藥用植物教研室王冰教授鑒定為蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分

2　方法與結果

2.1色譜條件

伊力特Hypersil ODS2色譜柱(4.6×250 mm，4.6μM)；流動相乙腈-水(12:88，V:V)；流速1.0mL/min；檢測波長325 nm；柱溫40℃，進樣量20 μL。

2.2對照品溶液制備及線性關系考察

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，得濃度為0.125 mg/mL的對照品儲備液。將該儲備液用甲醇逐級稀釋，配成濃度分別為0.0125、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 mg/mL的系列對照品溶液。將上述對照品溶液依次注入液相色譜儀，進樣量為20 μL。以峰面積為縱坐標，樣品濃度(mg/mL)為橫坐標，得回歸方程為y=3.04×106x+366，綠原酸在0.0125～0.125 mg/mL范圍內呈良好的線性關系(r=0.9995，n=6)。

2.3供試品溶液的制備

取萹蓄粉末(過40目篩)約2.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入100mL甲醇浸泡過夜，室溫超聲提取三次，每次20 min，過濾合并提取液，減壓濃縮至干后，以甲醇溶解后轉入10mL容量瓶中，定容至刻度，測定前置于4℃保存備用，進樣分析前經0.22μM濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4精密度試驗

精密稱取同一萹蓄藥材按2.3項下方法制成供試品溶液，連續進樣6次，測得保留時間RSD=0.64%，峰面積RSD=1.27%，表明儀器精密度良好。

2.5穩定性試驗

精密稱取同一萹蓄藥材按2.3項下方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24小時測定峰面積。平均峰面積為67266，RSD=2.69%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.6重復性試驗

精密稱取同一萹蓄藥材6份，按2.3項下方法制成供試品溶液，測得樣品中綠原酸含量的平均值為0.11 mg/g，RSD=1.14%，證明本方法重復性良好。

2.7加樣回收率試驗

取已知綠原酸含量(0.11 mg/g)的藥材9份，每份約2.0 g，精密稱量，3份為一組，置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度綠原酸對照品貯備液，按2.3項下方法制備供試品溶液，結果平均加樣回收率101.0%，RSD=1.62%(n=9)。

表1　加樣回收率試驗

2.8樣品含量的測定

分別取不同批次收集的萹蓄藥材約2 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，其色譜峰如圖1所示，記錄下峰面積，代入標準曲線，計算出樣品中含有綠原酸的含量，結果如表2所示。

圖1　萹蓄藥材HPLC圖

表2　萹蓄藥材中綠原酸含量測定結果

3　討論與結論

(1)萹蓄萹蓄為一年生草本植物，在播種當年的7-8月生長旺盛時采收，齊地割取全株，曬干或鮮用。其又名萹竹、扁竹蓼、扁豬牙等，《爾雅》郭璞注：萹蓄似小藜，赤莖節，好生道傍，可食，又殺蟲。其苦降下行，通利膀胱，苦燥又能殺蟲除濕止癢，主要用于淋痛及濕疹，還可治療蟯蟲等寄生蟲病。萹蓄在我國各地均產，以河南、四川、吉林等地產量較大。在在對遼寧千山地區的道地遼藥進行降糖活性的篩選過程中，我們發現委陵菜具有較強的α-葡萄糖苷酶體外抑制活性，提示其可能對二型糖尿病具有一定的治療作用。

(2)萹蓄中的化學成分主要有黃酮類、酚酸類、苯丙素類、生物堿類、萜類等、糖類等。目前對萹蓄的含量測定研究多集中在其黃酮類成分上，如有報道[3]以楊梅苷和槲皮苷等八種黃酮作為指標成分進行質量控制。然而，對萹蓄中酚酸類成分的含量研究則相對少見。綠原酸為萹蓄中的一種特征酚酸類成分，具有抗菌、抗病毒、升高白細胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂清除自由基等作用[7]，是許多藥材，包括萹蓄的主要有效成分之一研究綠原酸的含量分布，對于萹蓄藥材的質量控制具有重要意義。

(3)本文首次采取HPLC法，對3批產自遼寧千山地區的萹蓄藥材中的綠原酸進行了含量測定，結果分布在0.11～0.19 mg/g范圍內。我們所建立的檢測方法簡便、穩定、靈敏度高，可為萹蓄藥材的質量評價提供科學依據。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:334.

[2]徐燕,李曼曼,劉增輝,等.萹蓄的化學成分及藥理作用研究進展[J].安徽農業大學學報,2012,39(5):812-815.

[3]付慶榮,劉淑娟,王弘,等.RP-HPLC-UV法同時測定萹蓄中8個黃酮類化合物的含量(英文)[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2014,23(03):170-176.

[4]胥秀英,鄭一敏,傅善權,等.高效液相色譜法測定萹蓄中金絲桃苷等3種有效成分的含量[J].時珍國醫國藥,2006,17(4):563-564.

[5]陳娟,師彥平.HPLC測定萹蓄中槲皮素和山柰素的含量[J].中國中藥雜志,2009,34(4):423-427．

[6]吳衛華,康楨,歐陽冬生,等.綠原酸的藥理學研究進展[J].天然產物研究與開發,2006(04):691-694.

[7]陳紹華,王亞琴,羅立新.天然產物綠原酸的研究進展[J].食品科技,2008,33(02):195-199.

HPLC Method for Determination of Chlorogenic Acid in Polygonum aviculare L.*

DENG Shi-ren,ZHU Xia-min,WANG Xin,WANG Chun-jiao,XIA Lin-bo

(College of Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Dalian 116600,China)

An HPLC method for determination of chlorogenic acid in Polygonum aviculare L.was developed,to provide a quality control method for Polygonum aviculare L.The chromatography was carried out on an Elite Hypersil ODS2 column (4.6×250 mm,5μM) with acetonitrile-water (12:88,V:V) as the mobile phase,the detection wavelength was set at 325 nm.Chlorogenic acid could be successfully determined and the linear rang was 0.125～1.25 mg/mL (r=0.9995).The average recoveries(n=6) of the chlorogenic acid was 101.0%，RSD=1.62%.The content of chlorogenic acid in 3 batches was 0.11～0.19 mg/g.Chlorogenic acid was the specific ingredient in Polygonum aviculare L.The method is accurate,reliable and sensitive for quality control of Polygonum aviculare L.

Polygonum aviculare L.; chlorogenic acid; HPLC; determination

國家自然科學基金項目(81202857)；遼寧省自然科學基金(2015020713)；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃(LJQ2015070)。

鄧仕任(1979-)，男，博士，副教授。

夏林波(1977-)，女，博士，副教授，研究方向為中藥分析。

R284.1

A

1001-9677(2016)011-0152-02