三種方法提取益智揮發油的比較研究*

侯　杰，王　勇,，李永輝,，高炳淼，張俊清,，羅喻超

(1 海南醫學院藥學院，海南　海口　571199;2 海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南　海口　571199)

?

特稿

三種方法提取益智揮發油的比較研究*

侯杰1，王勇1,2，李永輝1,2，高炳淼2，張俊清1,2，羅喻超2

(1 海南醫學院藥學院，海南海口571199;2 海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南海口571199)

為了補充一種益智揮發油的提取方法，為益智揮發油質量控制及相關研究提供參考。采用水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法和超聲波輔助提取法正交實驗提取益智揮發油成分，用GC-MS對其進行鑒定，面積歸一化法測定相對含量。結果表明，三種提取方法的最佳工藝，不同方法提取的益智揮發油外觀性狀和產率不同，不同方法提取的揮發油化學成分種類和相對含量有較大差異。超聲波輔助提取法可以作為一種益智揮發油質量控制及相關研究的補充方法。

益智；揮發油；超聲波輔助提取；質量控制

益智(Alpiniaoxyphylla)為姜科植物,主產于中國海南省，為海南四大南藥之一。其成熟果實是益智的入藥部分，據藥典記載，益智性溫味辛，歸脾、腎經，具有溫脾止瀉、攝唾涎、暖腎、固精縮尿的功效[1]。益智揮發油揮發油具有抗菌、止瀉、強心、鎮痛、抗癌、拮抗鈣活性、降血脂、利尿等功效[2-3]。益智藥材揮發油化學成分的研究報道較多，陳新和吳惠勤等采用GC/MS鑒定了益智仁揮發油中的化合物[4-5]，易美華則分析了益智仁、莖、葉化學成分差異[7]。樊偉對益智仁乙醇提取物的抗氧化和抗腫瘤能力進行了評價，并分離純化得到了7個化合物[8]。

對益智研究的文獻較多，但藥典中關于益智質量標準簡單，2010 年版《中國藥典》(一部)[1]中僅規定益智種子含揮發油不得少于1.0%(mL/g)，而對于藥材標準中指標性成分的含量限度暫無規定，為益智藥材質量標準指標性成分的含量提供參考，水蒸氣蒸餾法提取揮發油在進行揮發性成分分析、藥材的道地性研究及質量控制存在不足之處[6]，本實驗通過三種方法提取益智果實揮發油成分，并利用GC-MS分析不同方法提取揮發油化學成分的差異，分析不同提取方法對揮發油化學成分的影響，為益智揮發油的研究及益智揮發油的質量控制提供新的補充提取方法。

1　實　驗

1.1儀器與材料

GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯用，日本島津公司；EYELA N-1100旋轉蒸發儀，日本理化；電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；金壇科析HH恒溫水浴鍋，金壇科析儀器有限公司；DZF-6020恒溫真空干燥箱，上海申賢恒溫設備廠；DFT-200粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；揮發油提取器；索氏提取器。

益智仁、石油醚(AR)、無水乙醇(AR)。

1.2揮發油的提取及樣品制備

水蒸氣蒸餾法：取30 g益智粉置于圓底燒瓶中，選擇粉碎度、浸泡時間、加水量、提取時間4因素運用L9(34)安排正交實驗。使用揮發油提取裝置提取揮發油，讀取提取揮發油含量。

索式提取法：取30 g益智粉至于圓底燒瓶中，選擇粉碎度、回流溫度、加入石油醚量、提取時間4因素運用L9(34)安排正交實驗。使用索氏提取器,稱取高良姜粉末30 g，加入石油醚,加熱回流提取，過濾提取液，45 ℃旋轉蒸發揮干石油醚,收集揮發油并稱重。

超聲波輔助提取法：稱取益智粉末30 g，選擇粉碎度、超聲功率、加入石油醚量、超聲時間4因素運用L9(34)安排正交實驗。使用超聲波清洗機用石油醚提取3次，每次加入石油醚并置于超聲波清洗器中開機處理，把3次的提取液合并過濾，45 ℃旋轉蒸發揮干石油醚，收集揮發油并稱重[9]。

樣品的制備：上述每種方法最佳提取的揮發油樣品用無水乙醇稀釋制備3個樣品溶液。

1.3氣相色譜-質譜分析(GC-MS)

(1)色譜條件

色譜柱：Rxi—5 ms(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；柱箱溫度：70 ℃ ；進樣模式：分流；流量控制模式：線速度；壓力：59.7 kPa；總流量：23.6 mL/min；柱流量：0.98 mL/min；線速度：36.3 cm/s；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：20.0；升溫程序：70～130 ℃，3 ℃/min；130～190 ℃，2 ℃/min；190～250 ℃，6 ℃/min。

(2)質譜條件

離子源溫度：230.00 ℃；接口溫度：250.00 ℃；溶劑延遲時間：2.00 min；檢測器增益方式：相對；檢測器增益：0.88 kV+0.00 kV；閥值：1000

2　結果與討論

2.1揮發油提取工藝優化

表1　水蒸氣蒸餾法提取因素水平Table 1　Factors and levels of steam distillation

表2　水蒸氣蒸餾法提取L9(34)正交實驗結果Table 2　L9(34)orthogonal experimental results by steam distillation

表3　水蒸氣蒸餾法提取正交實驗方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment by steam distillation

注：F0.05(2,2)=19；*表示差異有統計學意義。

水蒸氣提取正交實驗測定結果見表2，方差分析見表3。由試驗結果和方差分析顯示，水蒸氣提取各因素對提取的影響次序為B>D>A>C，即提取時間>加水量>粉碎度>浸泡時間。方差分析結果表明，在水蒸氣提取益智揮發油的工藝中，藥材的提取時間對得率有顯著影響，加液量、粉碎度與浸泡時間則無顯著影響。因此，為合理利用能源，考慮實際提取需要和條件，可確定蒸餾時間為8 h，加水量為400 mL。

根據正交實驗結果，確定提取益智揮發油的最佳工藝是A3B3C1D2，即藥材粉碎40目，提取時間8 h，浸泡時間6 h，加水量400 mL，以此工藝產率較高。

索式提取正交實驗測定結果見表5，方差分析見表6。由試驗結果和方差分析顯示，索式提取各因素對提取的影響次序為A>C>B>D，即粉碎度>回流溫度>提取時間>溶劑量。方差分析結果表明，在索式提取益智提取物的工藝中，粉碎度、對產率有顯著影響。

表4　索式提取因素水平表Table 4　Factors and levels of solvent extraction

表5　索式提取L9(34)正交實驗結果Table 5　L9(34)orthogonal experimental results by solvent extraction

表6　索式提取正交實驗方差分析Table 6　Variance analysis of orthogonal experiment by solvent extraction

注：F0.05(2,2)=19；*表示差異有統計學意義。

根據正交實驗結果，確定索式提取最佳工藝是A3B3C2D1，即藥材粉碎40目，回流溫度80 ℃，提取時間4 h，溶劑量300 mL，以此工藝得率較高。

表7　超聲輔助提取因素水平表Table 7　Factors and levels of ultrasonic assisted extraction

表8　超聲輔助提取L9(34)正交實驗結果Table 8　L9(34)orthogonal experimental results by ultrasonic assisted extraction

表9　超聲輔助提取正交實驗方差分析Table 9　Variance analysis of orthogonal experiment by ultrasonic assisted extraction

注：F0.05(2,2)=19；*表示差異有統計學意義。

超聲輔助提取正交實驗測定結果見表8，方差分析見表9。由試驗結果和方差分析顯示，超聲輔助提取各因素對提取的影響次序為A>C>D>B，即粉碎度>溶劑量>功率>提取時間。方差分析結果表明，在索式提取益智揮發油的工藝中，粉碎度、提取時間、超聲功率、溶劑量對產率均無顯著影響。

根據正交實驗結果，確定超聲輔助提取益智揮發油的最佳工藝是A3B2C2D1，即藥材粉碎40目，提取時間4 h，溶劑量400 mL，超聲功率15 kW，以此工藝產率高。

2.2揮發油GC-MS分析

圖1　益智揮發性成分的總離子流Fig.1　Total ion current of volatile components of Alpinia oxyphylla

三種樣品的總離子流見圖1～圖3，三種方法提取的揮發油中共有的化學成分為圓柚酮、芳樟醇、石竹烯、佛術烯、α-人參烯、長馬鞭草烯酮、桉油烯醇、長葉醛、蘭桉醇。三種方法提取揮發油中圓柚酮含量順序為：超聲波輔助提取、水蒸氣提取、索氏提取。

水蒸氣提取揮發油離子峰的成分含量較高的為對傘花烴、圓柚酮、桃金娘烯醛、1-甲基-4-(1-亞乙基)環己烯、α-蒎烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、氧化石竹烯、β-蒎烯、水芹烯、石竹烯、佛術烯、二表-α-雪松烯-1-氧化物、4-甲基(1-甲基乙基)-3-環己烯-1-醇、2-甲基-5-(1-甲乙基)苯酚、1,2,3,4-四氫-3-異丙基-5-甲基-1-萘酚、桉油烯醇等。其中對傘花烴和圓柚酮含量最高，這與Miao Q研究中的結果相同[10]。

與水蒸氣提取物相比，超聲提取物在保留時間小于20 min的揮發性成分缺失，但是在保留時間40～50 min之間含有水蒸氣提取物所不含有的揮發性成分，超聲輔助提取的成分中含量較高的有：圓柚酮、佛術烯、α-人參烯、蘭胺醇、氧化石竹烯、長葉松香芹酮、香橙烯、桉油烯醇、4，5-脫氫異長葉烯、4a，5,6,7,8,8a-六氫化-6-[1-羥甲基-乙烯基]-4,8a-二甲基，2(1H)-萘酮等。

索氏提取物中的化學成分與水蒸氣提取物中的成分和含量差異較大，其中索氏提取的成分中含量較高的有：4-4-羥基-3-甲氧基-2-丁酮、佛術烯、圓柚酮、石竹烯、α-人參烯、芳樟醇等。

3　結　論

(1) 三種提取方法中水蒸氣提取的揮發油呈清亮的淡黃色；索氏提取物呈黑褐色；超聲提取物呈黑褐色。從提取物顏色初步判斷，超聲提取和索氏提取物中雜質較多，此情況在GC/MS檢測也得到了證實。

(2)在提取溫度和提取時間上，超聲波提取無需加熱而且耗時少，彌補了水蒸氣蒸餾操作溫度高導致部分揮發油成分破壞的情況。超聲輔助提取最佳工藝得到的揮發油量高于水蒸氣提取，且超聲波提取的揮發油成分中含有長葉松香芹酮、香橙烯、桉油烯醇、4，5-脫氫異長葉烯、4a,5,6,7,8,8a-六氫化-6-[1-羥甲基-乙烯基]-4,8a-二甲基等，這些化合物均未出現在水蒸氣提取的化學成分中，這很好的補充了水蒸氣提取揮發油不充分的不足。

鑒于水蒸氣提取揮發油揮發性成分分析、藥材的道地性研究以及質量控制存在的不足之處，超聲波提取可以作為一種補充方法。

(3)關于超聲波輔助提取含有部分脂肪酸成分有待今后進一步研究確定，而索氏提取物中化學成分和含量與水蒸氣提取揮發油的差異較大，對于索氏提取物是否為揮發油還有待確定。

[1]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京:化學工業出版社,2010:273-274.

[2]陽辛鳳,利美蓮.益智成分，藥理和毒理的研究進展[J].熱帶農業科學,1999(3):66-68.

[3]張俊清,王勇,陳峰,等.益智的化學成分與藥理作用研究進展[J].天然產物研究與開發, 2013,25(2):280-287.

[4]陳新,劉曉靜,吳嬌,等.益智果實揮發油化學成分及抑菌活性研究[J].中國農學通報,2010, 26(22):366-371.

[5]吳惠勤,黃曉蘭,林曉珊,等.益智揮發油GC-MS指紋譜圖研究[J].廣西師范大學學報(自然科學版),2003,21(Z4):224-225.

[6]易美華,肖紅,梁振益.益智仁、葉、莖揮發油化學成分的對比研究[J].中國熱帶醫學, 2004,4(3):339-342.

[7]高素琴,朱春林.莪術揮發油提取工藝優化試驗研究[J].時珍國醫國藥,2000,11(10):878-878.

[8]樊偉.益智仁抗氧化和抗腫瘤成分的分離與活性研究[D].南京:華東理工大學,2014.

[9]龐啟華,何建華,曾潤娟,等.不同方法提取高良姜揮發油的比較研究[J].藥物生物技術, 2008,15(1):54-58.

[10]Miao Q, Kong W, Zhao X, et al. GC-FID coupled with chemometrics for quantitative and chemical fingerprinting analysis of Alpinia oxyphylla oil[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 102:436-442.

Comparison of Volatile Oil inAlpiniaoxyphyllaExtracted by Three Methods*

HOUJie1，WANGYong1,2，LIYong-hui1,2，GAOBing-miao2，ZHANGJun-qing1,2，LUOYu-chao2

(1 School of Pharmacy, Hainan Medical University, Hainan Haikou 571199;2 Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs, Hainan Haikou 571199, China)

To Compare the difference of volatile oil of the dryAlpiniaoxyphyllaextracted by different methods so as to supply data for quality control and research ofAlpiniaoxyphyllaMiq., volatile oil was extracted with orthogonal experiment of steam distillation, solvent extraction and ultrasonic assisted extraction. The compounds were identified by GC-MS and quantitatively determined with normalization method. Results showed that the optimum condition technology of three extraction methods, the color and yield of volatile oil were diverse. Difference was found in the kinds and relative content of component of volatile oil extracted by different methods. The ultrasonic assisted extraction can be used as a supplementary method of research and quality control ofAlpiniaoxyphyllaMiq. volatile oil.

Alpiniaoxyphylla; volatile oil; ultrasonic assisted extraction; quality control

國家自然科學基金(81560611)；海南省重大科技專項(ZDZX2013008-2)。

羅喻超，碩士，實驗師，研究方向：分子藥理學。

R9

B

1001-9677(2016)015-0001-04