響應面優化設計提取葡萄籽中的白藜蘆醇*

范秀文，高明波，曹雪杰，楊　婷，吳　嬌

(大連民族大學生命科學學院，遼寧　大連　116600)

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響應面優化設計提取葡萄籽中的白藜蘆醇*

范秀文，高明波，曹雪杰，楊婷，吳嬌

(大連民族大學生命科學學院，遼寧大連116600)

超聲輔助的雙水相萃取技術可提高葡萄籽中白藜蘆醇的提取率。實驗選取“雙優紅”葡萄釀酒殘渣中的葡萄籽為實驗材料，優化其中白藜蘆醇的提取方法。從16種雙水相體系中選出最優體系：聚乙二醇/磷酸氫二鉀/水。通過響應面優化實驗，得到的最佳提取工藝條件為：超聲時間1.5 h，超聲溫度為50 ℃，料液比1:15，乙醇濃度80%。在此條件下，以高效液相色譜法(HPLC)測定“雙優紅”葡萄籽中白藜蘆醇含量為0.38%。

葡萄籽；白藜蘆醇；雙水相；響應面優化設計；HPLC

葡萄又名蒲桃，為木質藤本植物，常分布于溫帶和亞熱帶。我國是葡萄遺傳資源較豐富的國家之一[1]。葡萄含有多種營養物質，深受食品加工行業的青睞。然而，葡萄的大量消費產生了大量葡萄廢棄物(皮、籽、梗)。葡萄廢棄物之一的葡萄籽總量約占總新鮮水果的7%～10%，大部分作為廢物遺棄。事實上，葡萄籽中含有多種芪類化合物，也稱為植物的應激產物，其中即有經濟附加值很高的白藜蘆醇[2]。白藜蘆醇又被稱為芪三酚，無色、無味、針狀晶體，不溶于水但易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑[3-4]，具有抗腫瘤、抗氧化[5]、抗自由基[6-7]、保護心血管[8-10]、抗菌、抗炎[11]、雌激素樣作用[12-13]和影響骨代謝作用[14-15]等功能。在法國、意大利、美國、西班牙等葡萄酒生產大國，70%以上的葡萄皮渣都得到很好的利用[16]。相對來講，我們國家葡萄釀酒后殘渣的利用不太理想，因此探索葡萄籽中白藜蘆醇的高效提取方法具有一定意義。

本實驗采用的超聲輔助的雙水相萃取法具有表面張力小、操作條件溫和、傳質快、平衡速度快、回收率高、分相時間短、含水量高、提取純度高等特點[17]。通過單因素和響應面優

化設計試驗，最終確定“雙優紅”葡萄籽中白藜蘆醇的最優提取條件，并以HPLC測定其含量。

1　實驗準備

1.1材料與試劑

“雙優紅”葡萄籽,由大連民族大學食品工程系提供；無水乙醇(分析純)、甲醇(液相純),購于天津市科密歐化學試劑公司；白藜蘆醇標準品,購于天津尖峰天然產物有限公司。

1.2主要儀器

ABS 80-4電子天平，KERN & Sohn GmbH；藥典篩(60目)，上海恒科儀器有限公司；S10H超聲波提取儀，Elma-Hans；H-2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHE-D(Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津。

2　實驗方法

2.1雙水相配制

本實驗共采用了16種雙水相體系，分別配制50%的甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇溶液，之后加入定量無機鹽使之分層。分相效果由R=V上/(V上+V下)判定，當R值越接近于R0=V上0/(V上0+V下0)其分相效果越好。V上、V下分別為分相后上下相體積，V上0、V下0分別為分相前有機溶劑體積和蒸餾水體積。R0=0.5時分相效果最好。R值如表1所示。

表1　16種雙水相體系的R值Table 1　R value of 16 two-phase aqueous system

從表1可以看出，甲醇、乙醇和正丙醇在硫酸銨和磷酸氫二鉀中的萃取效果較好，綜合考慮安全、環保、成本等問題，最終確定乙醇-水-磷酸氫二鉀為本實驗的最佳雙水相體系。

2.2白藜蘆醇標準曲線繪制

精密稱取白藜蘆醇2.5 mg溶于無水乙醇，定容到25 mL的棕色容量瓶中，獲得濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。將其依次稀釋為濃度為0.08，0.06，0.04，0.02 mg/mL的溶液，以無水乙醇為對照，在波長306 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線如圖1所示。

圖1　白藜蘆醇標準曲線Fig.1　The standard curve of resveratrol

2.3實驗流程

2.4單因素實驗

2.4.1超聲溫度選擇

取1 g過60目篩子的“雙優紅”葡萄籽粉末于燒杯中，加入15 mL無水乙醇封口超聲萃取1.0 h，并且分別設定溫度為40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃，80 ℃；取萃取液于離心管中，條件為4000 r/min，4 ℃，離心5 min；取上清液進行旋蒸；將離心后的產品倒入雙水相中，靜置1 h；以無水乙醇作為對照，取上清液在波長306 nm處測定吸光度值，根據標準曲線測得白藜蘆醇濃度。

2.4.2超聲時間選擇

取1 g過60目篩子的葡萄籽粉末于燒杯中，加入15 mL無水乙醇，分別封口超聲萃取1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，并且設定溫度為50 ℃。以下步驟同2.4.1。

2.4.3料液比選擇

取1 g過60目篩子的“雙優紅”葡萄籽粉末于燒杯中，分別加入8 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL無水乙醇封口超聲萃取1 h，并且設定溫度為50 ℃。以下步驟同2.4.1。

2.4.4乙醇濃度選擇

取1 g過60目篩子的葡萄籽粉末于燒杯中，加入15 mL的60%、70%、80%、90%、100%的無水乙醇封口超聲萃取1.0 h，并且設定溫度為50 ℃。以下步驟同2.4.1。

2.5響應面優化設計

在單因素實驗基礎上，根據Box-Behnken原理，以時間(A)、溫度(B)、料液比(C)和乙醇濃度(D)四個因子為自變量，以白藜蘆醇的吸光值(W)為響應值設計了四因素三水平的響應面分析實驗，實驗設計如表2所示。

表2　因素水平設計表Table 2　Factor and levels design table

3　結果與討論

3.1單因素實驗結果

超聲溫度、超聲時間、料液比、乙醇濃度的單因素實驗結果分別如圖2～圖5所示，根據單因素實驗結果，選定“雙優紅”葡萄籽中白藜蘆醇的最佳提取條件為：超聲溫度60 ℃，超聲時間1.5 h，料液比1:15，乙醇濃度70%。

圖2　溫度對白藜蘆醇提取的影響Fig.2　The influence of temperature on the extration of resveratrol

圖3　時間對白藜蘆醇提取的影響Fig.3　The influence of time on the extraction of resveratrol

圖4　料液比對白藜蘆醇提取的影響Fig.4　The effect of solid-liquid ratio on the extraction of resveratrol

圖5　乙醇濃度對白藜蘆醇提取的影響Fig.5　The effect of ethanol concentration on the extraction of resveratrol

3.2響應面優化實驗結果分析

響應面優化設計方案及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3　Box-Behnken實驗設計方案及結果Table 3　The experimental design of Box-Behnken and results

表4　方差分析表Table 4　Analysis of variance

由表4可知，模型Prob>F=0.0418值<0.05，線性以及平方均顯著，模型失擬項的Prob>F，值為0.2562>0.05，模型失擬項不顯著，模型選擇合適。從表4中F值的大小可以看出各因素對白藜蘆醇吸光值大小影響因素順序為：時間<料液比<溫度<乙醇濃度。將表3中的實驗數據選擇兩個交互的因素對白藜蘆醇提取影響進行分析，其他因素固定在零水平上，分析擬合響應3D曲面趨勢，如圖6所示。

圖6　各因素交互作用對白藜蘆醇得率影響的相應曲面(3D)Fig.6　The corresponding surface (3D) of the factors interaction on the yield of resveratrol

根據響應面優化設計結果，可預測出最優提取條件為：超聲溫度50 ℃，超聲時間1.5 h，料液比1:15，乙醇濃度80%。在該條件下重復進行三次實驗，測得的“雙優紅”葡萄籽中白藜蘆醇的含量高于單因素實驗測定的結果。

3.3優化實驗結果的高效液相圖譜

應用響應面優化實驗得到的實驗條件，提取“雙優紅”葡萄籽中的白藜蘆醇，以高效液相色譜測定含量。標準品圖譜及樣品圖譜如圖7和圖8所示，測得含量為0.38%。

圖7　白藜蘆醇標準品的HPLC圖Fig.7　HPLC of resveratrol standard

圖8　提取液的HPLC圖Fig.8　HPLC of the extractive

4　結　論

提取葡萄籽中的白藜蘆醇，可以變廢為寶，提高葡萄的附加值。本實驗采取超聲輔助雙水相法，提取“雙優紅”葡萄籽中的白藜蘆醇。在16種雙水相體系中，萃取效果最好的雙水相體系是無水乙醇/磷酸氫二鉀/去離子水。單因素實驗得到的最佳提取條件為：超聲溫度為60 ℃，超聲時間為1.5 h，料液比為1:15，乙醇濃度為70%，響應面優化實驗得到的最佳提取條件為：超聲溫度是50 ℃，超聲時間1.5 h，料液比為1:15，乙醇濃度為80%。在此優化條件下，提取了“雙優紅”葡萄籽中的白藜蘆醇，并通過HPLC測定其含量為0.38%。本實驗表明，葡萄酒釀制后的殘渣中，尤其葡萄籽中含有經濟價值較高的白藜蘆醇，可以提取利用。提取方法通過響應面優化設計，可以得到理想的提取效果。

[1]宮霞,錢正強,趙榕,等.中國野生葡萄屬資源研究與利用現狀[J].中外葡萄與葡萄酒,2010(05):75-79.

[2]建勇.天然芪類化合物的研究概況[J].天然產物研究與開發,1994(04):71-79.

[3]陳深.白藜蘆醇提純技術研究進展[J].精品與專用化學品,2011,19(3):39-42.

[4]Kimura Y,Ohminami H,Okuda H,et al. Effects of stilbene components of roots of Polygonum ssp.on liver injury in peroxidized oil-fed rats[J].Planta Medica,1983,49(9):51-54.

[5]韓晶晶,劉煒,畢玉平.白藜蘆醇的研究進展[J].生物工程學報,2008(11):1851-1859.

[6]Olas B,zbikowska HM,Waehowiez B,et al. Aeta Biochim Pol,1999,46(4):961-966.

[7]李永軍,李巍偉,王鑫,等.白藜蘆醇對葡萄球菌抗菌活性研究[J].中國實驗診斷學,2008(01):58-60.

[8]傅暾,張蓉,黃寶康,等.天然植物中活性成分白藜蘆醇的作用研究進展[J].現代中藥研究與實踐,2005,19(2):62-64.

[9]邢花,譚琴.白藜蘆醇提純與生理活性的研究進展[J].揚州大學烹飪學報,2011(02):57-60.

[10]王磊.中國的葡萄與葡萄酒發展現狀[J].科技創新導報,2010(13):231.

[11]曹雪杰,高明波,樸晶晶,等.雙水相萃取雙優紅葡萄籽中的白藜蘆醇[J].廣州化工,2015(11):65-67.

Response Surface Optimization in Extraction of Resveratrol from Grape Seeds*

FANXiu-wen,GAOMing-bo,CAOXue-jie,YANG-Ting,WU-Jiao

(College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116600, China)

Ultrasonic auxiliary aqueous two-phase extraction technology can improve the extraction rate of resveratrol from grape seeds. With “Shuangyouhong” grape seeds from remains of wine brewing as materials, the optimal extraction method of resveratrol was studied. From 16 kinds of aqueous two-phase system, the optimal system was selected as ethanol/dipotassiium phosphate/water system. With the response surface optimization experiment, the best extraction conditions were as follows: ultrasonic time was 1.5 h, ultrasonic temperature was 50 ℃, solid to liquid was 1:15, ethanol concentration was 80%. With this optimum condition, the resveratrol content of the “Shuangyouhong” grape seeds was determined to be 0.38% by HPLC.

grape seeds; resveratrol; aqueous two-phase system; response-surface design; HPLC

大連民族大學2015年大學生創新創業訓練計劃項目(S201512026016)。

范秀文(1994-)，女，本科生，制藥工程專業。

高明波(1974-)，女，副教授，博士，主要從事藥用植物方面的研究。

R284.2

B

1001-9677(2016)015-0073-05