超聲波輔助提取烏糾中總黃酮的工藝研究*

姜艷萍，李春榮， 孟鐵宏

(黔南民族醫學高等專科學校公共課教學部化學教研室，貴州　都勻　558000)

?

超聲波輔助提取烏糾中總黃酮的工藝研究*

姜艷萍，李春榮， 孟鐵宏

(黔南民族醫學高等專科學校公共課教學部化學教研室，貴州都勻558000)

為科學合理利用苗藥烏糾，利用超聲波輔助提取技術提取烏糾中的總黃酮，并采用紫外可見分光光度法測定了苗藥烏糾中總黃酮的含量，蘆丁標準曲線為A=0.0133C+0.0042，標準曲線相關系數R=0.9983。在檢測波長510 nm下，測得總黃酮含量為11.56 mg/g，平均回收率為99.7%，相對標準偏差(RSD)為0.60%(n=5)，實驗結果為今后苗藥烏糾的科學利用和質量控制研究提供了依據。

烏糾；黃酮；紫外分光光度法

苗藥烏糾是鐵角蕨科、鐵角蕨屬類植物變異鐵角蕨(Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.) 的全草，又名九倒生、鐵郎雞、地柏枝，主要分布在云南、貴州、四川和山西等地[1]。烏糾作為貴州苗族居住地區傳統的民間藥用植物，具有止血生肌，主治骨折，刀傷，瘡瘍潰爛，燒燙傷[2]。

迄今為止，鐵角蕨類植物化學成分的研究僅有過山蕨化學成分的研究報道[3]，對變異鐵角蕨烏糾的化學成分[4]，特別是黃酮類成分的研究還未見報道。本文采用紫外可見分光光度法測定了苗藥烏糾提取物中總黃酮的含量[5]，重復性好，簡便，易操作，為合理開發利用苗藥烏糾提供評價依據。

1　實驗準備

1.1藥材與試劑

烏糾：產地貴州苗族地區，經貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定為鐵角蕨科鐵角蕨屬植物變異鐵角蕨(Asplenium varians Wall.ex Hook.etGrev. )的全草。

蘆丁標準品(中國藥品生物制品鑒定所)，95%乙醇，NaNO2，A1(NO3)3，NaOH以上藥品均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2儀器

Sarteorius-BS110S電子分析天平；SG-4050C電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器；MU5100DUVFR實驗室超純水系統；cary100紫外可見分光光度計。

2　方法與結果

2.1標準曲線的繪制

準確稱在120 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品5.0 mg置于50 mL 容量瓶中，加60%乙醇超聲溶解，定容，搖勻，配制成濃度為100 μg/mL蘆丁標準品溶液[4]，作為貯備液備用。

精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標準品溶液于10 mL容量瓶，依次分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL搖勻，放置6 min，然后再加10% A1(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加1% NaOH溶液4 mL，用60%乙醇定容，顯色，靜置15 min后，用紫外可見分光光度計測510 nm處的吸光度[6-8]。試劑空白為參比，蘆丁標準品的濃度為橫坐標，510 nm處的吸光度為縱坐標作圖，得到蘆丁標準曲線見圖1。

圖1　蘆丁標準品吸光度-濃度標準曲線Fig.1　Standard rutin curve of absorbance-concentration

2.2重現性試驗

按照繪制標準曲線的方法，精密量取1.5 mL蘆丁標準溶液5份，按2.1標準曲線繪制操作方法進行測定吸光度。測定結果見表1，從表1測定結果可以看出，實驗的標準偏差和相對標準偏差都較小，說明實驗測定方法可取，實驗測定數據重現性良好[9]。

表1　蘆丁標準品重現性實驗結果Table 1　Result of repetition experiment of standard rutin

2.3樣品的測定

2.3.1樣品溶液的制備

準確稱取1.0000 g干燥的烏糾固體粉末，置于100 mL錐形瓶中，按料液比1:60加入60%乙醇溶液60 mL，放人超聲波提取器中，在3500 W 功率下進行超聲提取40 min，然后將提取樣品置于60 ℃進行水浴30 min，實驗完畢后，冷卻至室溫，過濾，濾液定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得到烏糾提取樣品溶液[10-11]。

2.3.2樣品中總黃酮含量的測定

準確量取樣品溶液2 mL于10 mL的容量瓶，依次加入5%的亞硝酸鈉、10%的硝酸鋁、1%的氫氧化鈉，用60%的乙醇定容。顯色后，利用紫外可見分光光度計按照標準曲線下設定的條件進行測定吸光度，樣品做5次平行測定。結合標準曲線擬合公式計算總黃酮含量，計算公式如下：

實驗測得苗藥烏糾中總黃酮含量為11.56 mg/g，相對標準偏差為0.60%。

表2　樣品中總黃酮含量測定結果Table 2　Result of determination of flavonoids of sample

2.3.3精密度試驗

準確量取樣品溶液1 mL于10 mL的容量瓶，按照標準曲線法進行操作，重復測定5次。實驗結果見表3，由表3可知，計算總黃酮含量測定結果的平均值為0.0815，相對標準偏差RSD為0.11%，說明實驗測定數據的精密度高，實驗的測定結果重現性較好。

表3　總黃酮精密度實驗結果Table 3　Result of precision experiment of flavonoids

2.3.4顯色時間的穩定性試驗

分別取蘆丁標準溶液和樣品測試液2.5 mL于10 mL的容量瓶，按照標準曲線法顯色后，每隔10 min測定一次，限定時間為2 h[12]。實驗結果表明，室溫下，當蘆丁標準溶液和樣品溶液均顯色后，在設定的時間范圍內，其吸光度隨時間的增加而變化并不大，說明在2 h內蘆丁標準品溶液和樣品溶液均是穩定的，為后續實驗結果的準確測定提供了保障。

2.3.5加標回收試驗[13]

根據加標回收試驗要求，向已知總黃酮含量的5份烏糾黃酮提取樣品溶液中分別加入5 mg的蘆丁標準品，按照樣品測定方法進行測定加入蘆丁標準樣品后的提取樣品溶液，由測定試驗結果，計算加標回收率。由表4實驗數據可知，加標回收率在99.2%～101.0%之間，平均回收率為99.7%，相對標準偏差RSD為0.81%，實驗結果符合回收率要求，說明用該方法測定總黃酮含量準確度良好，實驗方法可行。

表4　加樣回收率實驗結果Table 4　Results of addition recovery experiment

3　結　論

烏糾作為貴州苗族民間傳統藥用植物，含有大量的黃酮類成分，黃酮類物質具有降脂、降糖、降低血壓以及改善人體血液循環等多種生理活性[14]，在抑制癌癥，抗擊衰老等方面也發揮著重要作用，在醫藥領域具有極廣的應用前景。目前，烏糾作為貴州苗族地區傳統中藥材，其使用僅限于民間用藥，主要用于治療骨折、刀傷及皮膚燙傷等。

本文利用超聲波輔助提取技術提取，并通過紫外可見分光光度法測定了烏糾中總黃酮的含量為11.56 mg/g，相對標準偏差RSD為0.60%，實驗結果準確度高，偏差較小，以期為大力開發和科學利用烏糾價值提供實驗依據，也為今后測定鐵角蕨屬類植物中總黃酮的含量提供了一種簡便、易行的方法。

[1]胡成剛,趙能武,王培善,等.黔產鐵角蕨科藥用植物的種類和分布研究[J].安徽農業科學,2008,36(22):9607-9608.

[2]何順志.貴州中草藥資源研究[M].貴陽:貴州科學技術出版社,2007:189-195.

[3]李寧,李銑,馮志國,等.過山蕨中有機類化學成分研究[J].中草藥,2007,38(7):970-972.

[4]王玲,何兆榮.藥用蕨類植物化學成分研究進展[J].中國野生植物資源,2006,3(10):25-26.

[5]呂欣.紫外分光光度法測定甘草黃酮含量[J].植物研究,2005,27(1):66-68.

[6]陳文,王湘君,趙陽.海南五指山苦丁茶黃酮含量研究[J].瓊州學院學報,2011,18(5):14-16.

[7]姚志凌,李明輝.橘紅化瘀散中黃酮含量測定[J].光明中醫,2012,27(6):1108-1110.

[8]陳燁,陳圓圓.不同產地菊花的黃酮含量及純化[J].按摩與康復醫學,2014,5(3):147-149.

[9]鄭媛媛,李辰,封士蘭,等.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J].光譜學與光譜分析,2011,31(2):547-550.

[10]薛梅,王自軍,顏豫君,等.金櫻子中總黃酮和多糖的微波提取與含量測定[J].食品工業科技,2005,26(10):133-135.

[11]連林旺,張直峰,李瑜婷,等. 齒果酸模葉片總黃酮超聲波輔助提取工藝及抗氧化性[J].湖北農業科學,2014,53(14):3379-3382.

[12]吳鴻偉.石榴籽提取物中總黃酮含量測定[J].衡水學院學報,2009,11(4):54-56.

[13]李春榮,孟鐵宏.枇杷花茶中微量元素的溶出特性研究[J].山東大學學報(理學版),2014,49(7):7-11.

[14]韓公羽,沈企華.植物藥有效成分的研究與開發[M].杭州:杭州大學出版社,1991:94-102.

Determination of Flavonoids from Miao Medicine Asplenium varians Wall. ex Hook.et Grev. with Ultraviolet Spectrophotometry*

JIANGYan-ping,LIChun-rong,MENGTie-hong

(Qiannan Medical College for Nationalities, Guizhou Duyun 558000, China)

In order to scientific and reasonable use Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev., ultrasonic-assisted was used to extract flavonoids in Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev. The concentration of flavonoids in Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev. was determined with ultraviolet spectrophotometry. The egression equation of rutin standard curve was A=0.0133C+0.0042, R=0.9983, the relative standard deviation was 0.60% and the average recovery was 99.7%, the detection of total flavonoids was at 510 nm wavelength and its level was 11.56 mg/g(n=5), the results provided scientific basis for the utilization of Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.

Asplenium varians Wall.ex Hook. et Grev.; flavonoids; ultraviolet spectrophotometry

黔南民族醫學高等專科學校基金(QNYZ201510)；黔南州科技計劃項目(黔南州科合社字(2015)2號)；貴州省衛生廳校科技聯合基金(Gzwkj2012-2-018)。

姜艷萍(1963-)，實驗師，主要從事化學實驗教學及研究。

李春榮(1983-)，副教授，主要要從事分析化學教學及天然藥物研究。

O657

A

1001-9677(2016)015-0118-03