表面等離子體激元共振方法檢測三聚氰胺的含量

馮城婷

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南　長沙　410083)

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表面等離子體激元共振方法檢測三聚氰胺的含量

馮城婷

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410083)

基于三聚氰胺與DNA的反應(yīng)，建立了一種利用表面等離子體激元共振技術(shù)檢測三聚氰胺的方法。固定在芯片表面的NH2-A15捕獲T15-biotin和鏈霉親和素的混合溶液。當有三聚氰胺存在時，由于三聚氰胺可以與胸腺嘧啶(T)結(jié)合導(dǎo)致連接到芯片表面的T15-biotin和鏈霉親和素減少，SPR信號與沒有加入三聚氰胺時的信號值相比有所下降。因此，SPR信號的變化可反應(yīng)三聚氰胺的濃度。該方法對三聚氰胺的最低檢測濃度為0.32 nM，為檢測牛奶中三聚氰胺的含量提供了可能。

表面等離子體激元共振；三聚氰胺；胸腺嘧啶；檢測方法

三聚氰胺是一種分子式為C3H6N6的有機小分子化合物。由于它的氮含量高達66%，所以有不法商家將它添加到寵物食品或牛奶中，來增加其產(chǎn)品的氮含量[1-3]。然而，在嬰兒配方奶粉或其它奶制品中非法添加三聚氰胺會導(dǎo)致嬰兒患嚴重的疾病，如腎結(jié)石等[4-5]。因此，一種快速、靈敏、高效的方法來檢測牛奶和食品中的三聚氰胺含量的方法亟待開發(fā)。

目前，已有多種三聚氰胺的檢測方法被開發(fā)出來。其中，基于色譜、質(zhì)譜技術(shù)的方法雖有較高的檢測準確度和較低的檢測限，但設(shè)備昂貴且操作復(fù)雜[6-7]。酶聯(lián)免疫法(ELZISA)非常靈敏，但對于三聚氰胺類似物的區(qū)分不靈敏，影響實驗的準確性[8-9]。因此，需要開發(fā)快速、靈敏、成本較低的檢測方法來檢測三聚氰胺。

表面等離子體激元共振(surface plasmon resonance，SPR)是一種發(fā)生在兩種界面之間的物理光學(xué)現(xiàn)象[10]。SPR通過檢測芯片表面的質(zhì)量或折射率的變化來研究生物分子間的相互作用。該方法具有實時、免標記、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物分析等領(lǐng)域。本研究組曾經(jīng)開發(fā)了一種基于溶液中三聚氰胺與芯片表面固定的BSA-melamine偶聯(lián)物和溶液中固定濃度的三聚氰胺單克隆抗體之間的競爭反應(yīng)，通過檢測芯片表面結(jié)合的抗體所產(chǎn)生的SPR信號，對溶液中三聚氰胺進行定量的分析方法[11]。該方法快速靈敏，檢測限低達0.25 nM，但需要使用價格昂貴的抗體，且不能避免三聚氰胺類似物與抗體的相互作用所帶來的干擾。

由于三聚氰胺與胸腺嘧啶(Thymine)可以通過氫鍵特異性相互作用[12-13]，基于此開發(fā)了一種DNA修飾的SPR芯片來檢測三聚氰胺的方法。通過在芯片表面固定NH2-A15探針捕獲T15-biotin和鏈霉親和素(Streptavidin，SA)的復(fù)合物。當有三聚氰胺存在時，由于三聚氰胺與T15-biotin的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合到芯片表面的T15-biotin-SA復(fù)合物的量發(fā)生變化，從而檢測樣品中三聚氰胺的含量。

1　實　驗

1.1儀器與試劑

BI-FTA300表面等離子體激元共振儀，美國Biosensing Instrument公司。

16-巰基十六烷-1醇，美國Frontier Scientific公司；三聚氰胺、二乙二醇二甲醚、環(huán)氧氯丙烷、葡聚糖、溴乙酸、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、氨基乙醇鹽酸鹽(EA)、鏈霉親和素(SA)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)，均購自美國Sigma-Aldrich公司；其它試劑均為分析純，所有用水均為去離子水。

兩條DNA單鏈分別為5′-NH2-(CH2)6-AAA AAA AAA AAA AAA-3′(NH2-A15)、5′-biotin-CGC TTT TTT TTT TTT TTT-3′(T15-biotin)，上海生工生物有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)含10 mM K2HPO4、10 mM KH2PO4、137 mM NaCl、2.7 mM KCl，pH 7.4。三聚氰胺、DNA、SA均使用PBS緩沖液配制，0.4 M EDC、0.1 M NHS、1.0 M EA使用二次水配制。

值得肯定的是昆明市建設(shè)了“少數(shù)民族服務(wù)聯(lián)系平臺”“少數(shù)民族業(yè)務(wù)信息服務(wù)平臺”“少數(shù)民族創(chuàng)業(yè)促就業(yè)服務(wù)平臺”“少數(shù)民族糾紛調(diào)處和法律援助平臺”“清真食品管理平臺”“民族社團培育平臺”等六位一體的社會化管理服務(wù)平臺，及時傾聽民意、為民解困。

1.2.2SPR芯片的制備

本實驗使用的金膜購自美國Biosensing Instrument公司，使用前用H2火焰退火，除去金膜表面的雜質(zhì)。在金膜表面組裝羧甲基葡聚糖(CM-Dextran)的具體步驟為：首先將金膜用5 mM 16-巰基十六烷-1-醇溶液浸泡12 h；再放入0.6 M環(huán)氧氯丙烷中浸泡4 h，環(huán)氧氯丙烷用0.4 M NaOH和0.4 M二甘醇二甲醚溶液配制；再放入0.1 M NaOH溶液配制的0.3 g/mL Dextran溶液中浸泡20 h；最后用2 M NaOH配制的1 M溴乙酸溶液浸泡16 h。最終得到CM-Dextran芯片。

1.2.3SPR實驗

載液為PBS，使用前抽真空30 min。首先采用在線組裝的方式在芯片表面固定NH2-A15探針，實驗過程中控制流速在20 μL/min，其步驟為：先將200 μL 0.4M EDC和0.1 M NHS混合溶液注入到200 μL進樣環(huán)中，通過SPR儀器內(nèi)六通閥的作用將溶液流過芯片表面，活化羧基；隨后通過氨基與羧基的反應(yīng)將NH2-A15固定在芯片表面；最后用1.0 M EA封閉芯片表面未結(jié)合位點。接著將不同濃度的三聚氰胺和固定濃度的T15-biotin在4 ℃下混合12 h后，再將50 nM SA加入混合溶液中反應(yīng)1 h。在流速為6 μL/min的條件下把最終得到的混合溶液200 μL流動注射到固定有NH2-A15探針的SPR通道中。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測原理

圖1　基于三聚氰胺與胸腺嘧啶相互作用的SPR檢測三聚氰胺的示意圖Fig.1　Schematic representation of SPR detection of melamine via thymine-melamine recognition

實驗原理如圖1所示。首先將NH2-A15探針固定在CM-Dextran芯片表面，并用EA封閉芯片表面未結(jié)合位點。當沒有三聚氰胺存在時，SA-biotin-T15復(fù)合物和NH2-A15雜交，產(chǎn)生一個較大的SPR信號。當存在三聚氰胺時，由于三聚氰胺和胸腺嘧啶的相互作用，導(dǎo)致與NH2-A15雜交的SA-biotin-T15復(fù)合物的量減少，SPR信號降低。隨著溶液中三聚氰胺濃度的增加，SPR信號降低。

2.2方法的非特異性探索

圖2　在固定了NH2-A15探針的芯片表面注射50 nM T15-biotin和 50 nM SA混合溶液(a),50 nM T15和50 nM SA混合溶液(b), 50 nM T15、50 nM SA和1.58 μM三聚氰胺混合溶液(c)和 50 nM SA(d)所產(chǎn)生的SPR信號Fig.2　SPR sensorgrams acquired upon injections of the complex between 50 nM T15-biotin and 50 nM streptavidin(a), 50 nM T15+50 nM streptavidin(b), 50 nM T15+50 nM streptavidin + 1.58 μM melamine(c) and 50 nM streptavidin(d) into the fluidic channels pre-covered with NH2-A15

2.3方法的可行性分析

圖3　在固定了NH2-A15探針的芯片表面注射 50 nM T15-biotin和50 nM SA混合溶液(a), 50 nM T15-biotin、50 nM SA和158 nM三聚氰胺混合溶液(b), 50 nM T15-biotin、50 nM SA和1.58 μM三聚氰胺混合溶液(c)和 1.58 μM三聚氰胺(d)所產(chǎn)生的SPR信號Fig.3　SPR sensorgrams corresponding to the injections of the complex between 50 nM T15-biotin and 50 nM streptavidin(a), a + 158 nM melamine(b), a + 1.58 μM melamine(c) and 1.58 μM melamine(d) into the NH2-A15-modified chips

該方法使用競爭雜交法，其可行性分析如圖3所示。在固定了NH2-A15探針的羧甲基葡聚糖芯片表面注射50 nM T15-biotin和50 nM SA的混合溶液，產(chǎn)生的SPR信號為77.65 mDeg(曲線a)。這個信號是復(fù)合物SA-biotin-T15與NH2-A15探針雜交所產(chǎn)生的。當混合溶液中添加158 nM三聚氰胺時，SPR信號降低為52.49 mDeg(曲線b)。這說明三聚氰胺確實能夠抑制T15-biotin與NH2-A15的雜交作用，這是因為三聚氰胺占據(jù)了T15與A15的部分雜交位點，從而使結(jié)合在芯片表面的SA-biotin-T15復(fù)合物的量減少，SPR信號降低。當添加的三聚氰胺濃度增加到1.58 μM時，SPR信號繼續(xù)降低到33.18 mDeg(曲線c)。這說明隨著三聚氰胺濃度的增加，抑制作用增強，SPR信號降低。曲線d為將1.58 μM三聚氰胺直接注射到固定了NH2-A15探針的芯片表面，所產(chǎn)生的信號非常小，只有2.83 mDeg，這說明三聚氰胺在芯片表面沒有非特異性吸附。以上實驗表明使用競爭雜交法來檢測三聚氰胺的含量是可行的。

2.4芯片再生

如圖4所示，注射100 mM NaOH溶液來進行芯片表面的再生。100 mM NaOH可以使雙鏈解旋，復(fù)合物SA-biotin-T15被洗脫下來，而探針NH2-A15保留在芯片表面，SPR信號回到樣品注射前的狀態(tài)。由圖4可看出，洗脫后的芯片可實現(xiàn)對樣品的連續(xù)檢測。通過5次再生，DNA雜交所產(chǎn)生的SPR信號降低程度低于5%。所以通過芯片的多次再生，可以在同一芯片上進行多個樣品分析，降低了實驗的誤差，減少了測量時間。

圖4　芯片表面的三次再生Fig.4　A sensorgram showing three repeated cycles for the injections of the complex between 50 nM T15-biotin and 50 nM streptavidin onto the ODN probe-covered SPR chip (arrow a)and the regenerations of the chip surface with 100 mM NaOH solution (arrow b)

2.5工作曲線

圖5為該方法檢測三聚氰胺濃度的工作曲線。其中三聚氰胺的濃度分別為0.32、3.2、16、32、1.6×102、3.2×102、6.3×102、1.6×103、3.2×103和3.2×104nM。方法的線性范圍分為：0.32～32 nM和32～630 nM。兩段的線性方程分別為Δθ/mDeg=73.49-0.55[melamine]/nM，R2=0.966；Δθ/mDeg=56.65-0.03[melamine]/nM，R2=0.995。所得的三聚氰胺最低檢測限為0.32 nM，遠遠低于通過HPLC法或ELISA法所得到的最低檢測限，也低于所規(guī)定的嬰幼兒配方奶粉中三聚氰胺的限量。

圖5　SPR法檢測三聚氰胺濃度的工作曲線Fig.5　Dependence of the SPR dip shift on the concentrations of melamine

2.6牛奶樣品的非特異性吸附的消除

在牛奶樣品中檢測三聚氰胺的含量，需要消除樣品中其它干擾物質(zhì)的非特異性吸附。首先，將奶粉溶解在水中，用乙酸稀釋。超聲15 min后，將溶液在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min 以除去任何不溶性物質(zhì)，并通過0.22 μm的膜過濾器過濾上清液。將所得上清液用3 kDa的超濾離心管以10000 r/min再次離心30 min，收集濾液。將所得到的濾液分別稀釋10、20、100倍，流動注射進固定了NH2-A15探針的羧甲基葡聚糖芯片表面，所得的SPR信號圖如圖6所示。最終得到的SPR信號值分別為12.28 mDeg(a)，10.43 mDeg(b)和7.53 mDeg(c)。這表明經(jīng)預(yù)處理牛奶樣品稀釋100倍后，其非特異性吸附可以忽略不計。因此，本文介紹的方法對于實際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測具有巨大潛力。

圖6　預(yù)處理后的牛奶樣品經(jīng)PBS稀釋后所產(chǎn)生的非特異性吸附Fig.6　The SPR sensorgrams showing the nonspecific adsorption of the pretreated milk diluted with PBS

3　結(jié)　論

本方法基于競爭雜交法使用SPR技術(shù)檢測三聚氰胺含量。將三聚氰胺加入到T15-biotin和鏈霉親和素的混合溶液中，由于三聚氰胺與胸腺嘧啶間的相互作用，三聚氰胺與預(yù)先固定的NH2-A15探針競爭T15-biotin序列，導(dǎo)致結(jié)合在芯片表面的SA-biotin-T15復(fù)合物的量減少，SPR信號降低。該方法檢測限低(0.32 nM)、重現(xiàn)性好(RSD<5%)、免標記、芯片表面可再生，有望用于牛奶樣品中三聚氰胺的檢測。該方法也為SPR技術(shù)檢測小分子化合物提供了一個有效的思路。

[1]Brown C A, Jeong K S, Poppenga R H, et al. Outbreaks of renal failure associated with melamine and cyanuric acid in dogs and cats in 2004 and 2007[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2007, 19(5): 525-531.

[2]Ai K, Liu Y, Lu L. Hydrogen-bonding recognition-induced color change of gold nanoparticles for visual detection of melamine in raw milk and infant formula[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(27): 9496-9497.

[3]Tyan Y C, Yang M H, Jong S B, et al. Melamine contamination[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 395(3): 729-735.

[4]Burns K. Events leading to the major recall of pet foods[J]. Journal of the American Veterinary Medical Association, 2007, 230(11): 1600-1620.

[5]Chen J S. What can we learn from the 2008 melamine crisis in China?[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2009, 22(2): 109-111.

[6]Ibanez M, Sancho J V, Hernandez F. Determination of melamine in milk-based products and other food and beverage products by ion-pair liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 649(1): 91-97.

[7]Xu X M, Ren Y P, Zhu Y, et al. Direct determination of melamine in dairy products by gas chromatography/mass spectrometry with coupled column separation[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 650(1): 39-43.

[8]Garber E a E, Brewer V A. Enzyme-linked immunosorbent assay detection of melamine in infant formula and wheat food products[J]. Journal of Food Protection, 2010, 73(4): 701-707.

[9]Zhou Y, Li C Y, Li Y S, et al. Monoclonal antibody based inhibition ELISA as a new tool for the analysis of melamine in milk and pet food samples[J]. Food Chemistry, 2012, 135(4): 2681-2686.

[10]Stern E A, Ferrell R A. Surface Plasma Oscillations of a Degenerate Electron Gas[J]. Physical Review, 1960, 120(1): 130-136.

[11]劉珊珊, 衣馨瑤, 王建秀. 牛血清白蛋白-三聚氰胺偶聯(lián)物修飾的表面等離子體激元共振芯片檢測三聚氰胺含量[J]. 分析化學(xué), 2014(5): 695-700.

[12]Jiang Z, Zhou L, Liang A. Resonance scattering detection of trace melamine using aptamer-modified nanosilver probe as catalyst without separation of its aggregations[J]. Chemical Communications, 2011, 47(11): 3162-3164.

[13]Zeng Y, Pratumyot Y, Piao X, et al. Discrete assembly of synthetic peptide-DNA triplex structures from polyvalent melamine-thymine bifacial recognition[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(2): 832-835.

Surface Plasmon Resonance for Melamine Detection

FENGCheng-ting

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Hunan Changsha 410083, China)

Surface plasmon resonance (SPR) assay of melamine was carried out based on the competitive reaction of melamine and DNA. The oligonucleotide probe (NH2-A15) was first immobilized onto the carboxymethylated dextran-covered SPR chips, followed by the injection of the mixed solution of T15-biotin and streptavidin (SA). Due to the interaction between melamine and thymine, the amount of the SA-biotin-T15complex linked to the chip surface was decreased when adding melamine. By examining the SPR responses caused by the attached SA-biotin-T15complex, the concentrations of melamine could be determined. The detection limit of this method was 0.32 nM, which held great promise for melamine assay in milk samples.

surface plasmon resonance; melamine; thymine; detection method

馮城婷(1992-)，女，碩士研究生，主要從事分析化學(xué)的檢測與應(yīng)用。

O657.39

A

1001-9677(2016)015-0120-04