禽畜肉中金剛烷胺殘留量測定的不確定度評定

尹麗麗

(上海天祥質量技術服務有限公司，上海　200233)

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禽畜肉中金剛烷胺殘留量測定的不確定度評定

尹麗麗

(上海天祥質量技術服務有限公司，上海200233)

建立LCMSMS方法測定禽畜肉中金剛烷胺殘留量的方法，并進行了不確定度評定。本文中的不確定度評定數學模型是根據CNAS-GL06-2006《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》建立的，并對主要影響因素進行了分析，得到了此測定方法的不確定度報告。結果表明：禽畜肉中的金剛烷胺殘留量用LCMSMS方法測定，其不確定度主要來源于所用儀器，標準溶液的配制過程和校準曲線的擬合。

液相色譜-串聯質譜；動物源性食品；金剛烷胺；不確定度

鹽酸金剛烷胺為一種對稱的三環狀胺，在病毒進入宿主細胞過程中起到抑制作用，還對病毒的脫殼有影響，并對其繁殖進行抑制，因此用作治療和預防病毒性感染，并對由于A型流感病毒引起的呼吸道癥狀有很好的治療作用[1-2]。金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，在抑制人流感病毒方面，金剛烷胺具有價格低廉，效果明顯等特點。目前還曾在獸醫臨床上用于動物病毒病的預防和治療，但并沒被批準用作獸醫，畜禽如果用人類的抗病毒藥物，則很有可能引起病毒變異，進而影響人類用藥的效果，并且可能導致動物病毒產生耐藥性以及免疫抑制，如果不明確機理，還有可能導致藥物在動物體內產生殘留，間接影響人類健康[3-4]。我國農業部在2005年發布了第560號公告，其中明確禁止在獸藥領域生產和銷售金剛烷胺[5]。2006年美國FDA也明令禁止將金剛烷胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類[6]。

關于該類藥物報道較多的是人血漿和藥物中金剛烷胺類藥物中金剛烷胺類藥物的測定方法，主要包括氣相色譜法[1]、液相色譜法[7-10]、毛細管電泳法[11]和液相色譜-串聯質譜法[12-14]等。目前發布的金剛烷胺殘留測定方法只有兩個地方標準：DB32/T1163-2007 雞肝中金剛烷胺殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法，DB21/2394-2014 雞肝和雞肉中金剛烷胺 金剛乙胺的檢測 超高效液相色譜串聯質譜法(2015-6-29實施)，參考標準及多次實驗建立了我們實驗室自己的測定方法，然而一切測量結果都不可避免地具有不確定度。本文依據法規CNAS-GL06-2006《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》，分析了用LCMSMS方法測定金剛烷胺測量結果的不確定度，從而明確了測量結果準確性的影響因素，為得到更可靠準確的結果提供了理論基礎和科學依據。

1　實　驗

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

甲醇(色譜純)，美國天地；乙腈(色譜純)，美國天地；乙酸銨(優級純)，上海安譜；甲酸(優級純)，上海安譜；三氯乙酸(分析純)，國藥集團；氨水(分析純),國藥集團；金剛烷胺標準品(純度97.5%)，上海安譜；金剛烷胺-D15標準品(純度98%)，TRC；實驗用水均為Millipore系統產生的超純水。

1.1.2儀器

THERMO液相色譜系統，賽默飛世爾科技公司；三重四極桿質譜分析儀(配有電噴霧離子源)，賽默飛世爾科技公司；高速均質器，上海標本模型廠；渦旋混勻器，上海精科實業有限公司；高速冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；氮吹濃縮儀，上海安譜；超聲波儀器，上海科導超聲儀器有限公司；MS204S電子天平，梅特勒托利多；XS105電子天平，梅特勒托利多。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的配制

準確稱量金剛烷胺和金剛烷胺-D15標準品配制成需要且合理濃度的標準儲備液和標準中間液體，再由標準中間液配制成金剛烷胺濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL，內標金剛烷胺-d15濃度為25.0 ng/mL的標準工作液。

1.2.2樣品制備

稱取2 g(精確到0.01 g)試樣至50 mL離心管中，然后加入100 μL 的0.1 μg/mL金剛烷胺-D15內標，再加入15 mL乙腈提取液，渦旋振蕩1 min，超聲10 min，4000 r/min冷凍離心15 min，上清液轉移至另一50 mL離心管中，重復上述操作，合并上清液，加入10 mL正己烷輕微振搖3 min，4000 r/min冷凍離心5 min，除去正己烷層，轉移提取液到氮吹管，并氮吹至干，用1 mL水復溶，渦旋超聲溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。

2　數學模型建立

樣品中金剛烷胺含量計算公式如下：

式中：X——樣品中金剛烷胺含量，μg/kg

A——樣液中金剛烷胺的峰面積

Ci——樣液中金剛烷胺-D15的濃度，ng/mL

Ais——標準物質中金剛烷胺-D15的峰面積

Cs——標準物質中金剛烷胺的濃度，ng/mL

Ai——樣液中金剛烷胺-D15的峰面積

As——標準物質的峰面積

Cis——標準物質中金剛烷胺-D15的濃度，ng/mL

V——定容體積，mL

M——樣品質量，g

df——稀釋倍數

根據內標法的計算特點，可以知道樣液中金剛烷胺與其內標物的質量濃度比C是由A,Ci,Ais,Cs,Ai,As,Cis各分量計算而來，因此由這幾個分量產生的不確定度，可以歸入C中，而又因為隨機影響的重復性系數frep值為1，則上面的計算公式可簡化為：

3　分析不確定度的來源[15-18]

通過測試過程步驟以及數學模型，可以確定不確定度的主要來源有：回收率產生的不確定度，液質聯用儀器定量校準產生的不確定度，樣品稱量產生的不確定度，校準曲線擬合過程產生的不確定度，制備樣液過程中的定容體積產生的不確定度，儀器定量重復性產生的不確定度，配制標準曲線過程產生的不確定度。

4　不確定度各分量的計算

4.1試樣測試過程中由重復性引入的不確定度

在金剛烷胺樣品中加標，重復測定6次，表1為測定結果。

表1　重復測定加標樣品的結果Table 1　Results of spiked sample determination

單次測量的試驗標準偏差：

因此，由測量重復性引入的相對標準不確定度為：

4.2試樣稱量時產生的不確定度

準確稱量樣品2.0000g，所用天平校準允許的最大誤差為±0.0001g，按均勻分布考慮，則稱量試樣產生的相對標準不確定度為：

4.3試樣制備過程中定容體積引入的不確定度

4.4液質聯用儀器定量校準引入的不確定度

測試所用儀器外校證報告給出擴展不確定度urel=6.8%，K=2，由此，液質聯用儀器產生的相對標準不確定度為：

urel(LCMSMS)=0.068/2=0.034

4.5標準曲線配制過程產生的不確定度

4.5.1配制標準儲備液產生的相對標準不確定度urel(C1)

(1)金剛烷胺和金剛烷胺-d15標準品證書給出純度分別為98%和97.5%，由標準品純度引入的不確定度為：

(2)天平允許的最大誤差為±0.01 mg，稱取標品金剛烷胺和金剛烷胺-d15分別是1.00 mg和10.00 mg，取矩形分布，產生的相對標準不確定度為：

(4)合成得到標準儲備液配制的相對標準不確定度urel(C1)

4.5.2中間標準溶液配制所產生的相對標準不確定度urel(C2)

=0.00930

4.5.3由標準中間液稀釋配制標準工作液產生的相對標準不確定度urel(C3)

配制標準工作液過程中主要是由玻璃量器帶入的不確定度，根據規程JJG196-2006[19]的要求，并按三角分布考慮，則標準曲線配制過程中由玻璃量器所產生的不確定度見表2。

表2　標準曲線配制過程中玻璃量器所產生的不確定度Table 2　The uncertainty of the process of glass volume calibrationproduces standard working solution preparation

由于0.1 mL移液管在配制過程中使用了4次，0.25 mL移液管在配制過程中使用了5次，10 mL單標線容量瓶使用了5次，因此標準工作液配制過程玻璃量器產生的合成相對標準不確定度為：

=0.0148

古詩文中理的第二個層次是對生命啟迪。曾經滄海難為水,除卻巫山不是云。這句也是情理相融的經典代表詩句。為什么會這么說呢？據說寫這首詩的作者，深深愛著他的家人，后來在他的家人離開他之后，他深深的懷念著。然后就寫下了這兩句詩“曾經滄海難為水，除卻巫山不是云。”在作者妻子離開他之后，他看到生活中各種各樣的人和事物，都已經無法動心了。“曾經滄海難為水”意思就是說，看到過很多很多的河水，直到見識過了滄海。從此以后，再看普通的水，就已經沒有感覺了。“除卻巫山不是云”意思是指巫山的云變化綺麗，所以見識過巫山的云之后，平平常常的云，再也無法激發起他心中的熱情。作者以此來表示他對妻子的深深地懷念。

4.5.4金剛烷胺標準曲線配制過程所產生的相對標準不確定度urel(C)

4.6金剛烷胺標準曲線擬合過程所產生的不確定度

標準曲線一共由5個濃度點組成，每個濃度水平測定一次，根據所得到的相應的峰面積，用最小二乘法擬合，可得曲線方程Y=aC+b，以及相關系數R，y為金剛烷胺與內標物濃度的比值，x為金剛烷胺與內標物的峰面積比值，見表3。

表3　曲線各濃度點測定結果及擬合方程Table 3　The results of the determination of theconcentration point of the curve and fitting equation

注：a=0.10372，b=-0.01357，R=0.9995

對于同一試樣，測定7次，由上述校準曲線計算所得結果見表4。

表4　試樣溶液測定結果Table 4　Results of sample solution measurement

則校準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C0)可由下式計算得到：

式中：a——校準曲線的斜率

p——試樣測定次數

m——標準曲線各濃度點重復測定次數

Sy/c——標準曲線的標準偏差

Sc/c——標準曲線各個濃度點的離均差平方和

Yij——標準曲線各個濃度點的響應值

Yi——由線性方程計算所得的響應值

Ci——標準曲線各濃度點濃度值

C0——試樣溶液的平均濃度

由上述公式計算得到的結果見表5。

表5　標準曲線用最小二乘法擬合時產生的相對標準不確定度urel(C0)Table 5　The uncertainty urel(C0) of least square curve fitting

5　各個過程產生的相對標準不確定度的合成與擴展

由前面的試驗結果可知，試樣中金剛烷胺殘留量為 2.5μg/kg，因此其標準不確定度為：

u(X)=urel(X)2.5=0.120

取包含因子k=2，則金剛烷胺擴展不確定度為：

U=K×u(X)=2×0.120 =0.24

6　結　論

由本試驗得出，當k=2(95%置信度)時，金剛烷胺的測定結果可表示為(2.5±0.24)μg/kg，并且根據文中各個不確定度分量的計算，可知本方法測定金剛烷胺，不確定度的主要來源為所用儀器，其次是標準溶液的配制過程和校準曲線的擬合，因此平時測試工作中，應按規程定期的做好儀器的維護及校準，在配制標準溶液時，操作要規范，養成良好正確的習慣，使得測試結果更為可靠。

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Amantadine Residues in Animal Derived Food by LC-MS-MS

YINLi-li

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

A LC-MS-MS method was set up to detect amantadine residues in animal derived food and evaluated the uncertainty of this method. According to the principle and method in CNAS-GL06-Guidance on evluating the Uncertainty in Chemical Analysis and JJF1059.1-2012 Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement, the main influence factors of the uncertainty were analyzed, a mathematic model was established, and the report of the detect method’s uncertainty was created. The results showed that the major factors of uncertainty in measurement were the instrument, preparation of standard solution and fitting of calibration curve.

LC-MS-MS; animal derived food; amantadine; uncertainty

尹麗麗(1980-)，女，碩士研究生，主要從事食品檢測與分析。

TS207.7

A

1001-9677(2016)015-0137-04