包涵體蛋白3種純化方法的比較

柴燕濤　姜棋予　謝國明　胡　燕　鄔順全　楊銳創　貌盼勇　侯　俊解放軍第三〇二醫：臨床研究管理中心，北京100039

包涵體蛋白3種純化方法的比較

柴燕濤*姜棋予*謝國明胡燕鄔順全楊銳創貌盼勇侯俊▲
解放軍第三〇二醫：臨床研究管理中心，北京100039

目的比較3種純化方法對表達的腸道病毒71型（EV71）VP1區包涵體蛋白的純化效果。方法分別用差速離心法、固定化金屬離子親和層析（IMAC）及不同濃度飽和硫酸氨沉淀法3種包涵體蛋白純化法對原核表達EV71 VP1包涵體蛋白進行純化，蛋白垂直（SDS-PAGE）電泳檢測蛋白純化效果。結果差速離心法可以進行大批量表達蛋白純化，純化效果較好，但存在蛋白損失較多，且純化蛋白不能反復凍融的問題。IMAC柱純化獲得的蛋白純度較高，且蛋白性狀穩定，但仍存在純化蛋白量較少的問題。飽和硫酸氨沉淀純化法無法獲得純度較高的包涵體蛋白。結論差速離心法可用于大批量蛋白純化，純化蛋白應避免反復凍融，可小量分裝凍存后備用。IMAC柱純化可獲得純度較高且性狀相對穩定的純化蛋白，其在相應抗體檢測方法學的建立及疫苗制備方面均有廣泛用途。飽和硫酸氨法只適用于表達蛋白的初步濃縮純化。

包涵體蛋白曰蛋白純化曰蛋白垂直電泳

[Abstract]Objective To compare the expressed inc1usion body protein of EV71 VP1 with three purification methods. Methods The expressed EV71 VP1 inc1usion body protein was purified by differentia1 centrifugation,IMAC co1umn purification and ammonium su1fate precipitation.SDS-PAGE experiments determinate the purity effects.Results Expressed inc1usion body purification in 1arge quantities cou1d been undertaken by differentia1 centrifugation and the purification effect was better but with a 1ot of protein 1oss and the purified protein cou1d not be repeated1y frozen and thawed.The purification effect of IMAC was good and stab1e,but 1ess purified protein was purified.High purity of inc1usion body protein wasn′t obtained by ammonium su1fate precipitation.Conclusion Differentia1 centrifugation is app1icab1e in 1arge quantities of protein purification,but avoid repeated1y freezing and thawing.The protein purification of IMAC can be used to estab1ish corresponding antibody detection methods.The ammonium su1fate precipitation is on1y app1icab1e for the pre1iminary purification of the expressed proteins.

[Key words]Inc1usion body protein;Protein purification;SDS-PAGE e1ectrophoresis

包涵體是外源基因在細胞中表達量過高形成的一種膜包裹的高密度、不溶性蛋白顆粒。該蛋白不具有生物學活性，其分子的空間結構表現為非折疊態的聚集體，復性后可恢復其生物學活性[1]。研究發現外源基因低表達時很少形成包涵體，蛋白表達合成速度越快、量越高越容易形成包涵體[2-4]。包涵體純化方法有色譜法、離子交換層析、親和層析、疏水層析、雙水相萃取技術、反膠團相轉移技術、凝膠過濾層析等[5-13]，不同的方法間純化效果有明顯差異。為尋找一種簡單、快速的純化方法，本研究用3種實驗室常用的包涵體蛋白純化方法對腸道病毒71型（EV71）VP1包涵體蛋白進行純化，并對其純化效果進行比較，希望能為相關抗體檢測試劑盒的研制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

胰蛋白胨、酵母提取物購自英國OXIOD公司，30%丙烯酰胺購自美國NOVON公司，IMAC純化柱購自北京天恩澤科技有限公司，化學試劑購自北京化學試劑公司。

1.2重組質粒的構建及表達

EV71 VP1重組表達質粒的構建、表達均由解放軍第三〇二醫：臨床研究管理中心（以下簡稱“本：”）完成[14-18]。

1.3表達蛋白可溶性鑒定

EV71 VP1包涵體蛋白7000 r/min 4℃離心10 min后，沉淀溶于30 mL PBS中，反復凍融3次后，冰浴條件下超聲20次。分離上清和沉淀進行蛋白垂直（SDS-PAGE）電泳，觀察表達蛋白均為包涵體蛋白。

1.4差速離心純化包涵體蛋白

取10 mL包涵體蛋白液，1000 r/min，4℃離心30 min后，棄沉淀，上清7000 r/min 4℃離心10 min后，沉淀溶于10 mL PBS中；1000 r/min 4℃離心30 min后，上清7000 r/min 4℃離心10 min，反復差速離心至包涵體蛋白出現瓷白色。SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

1.5 IMAC純化柱純化包涵體蛋白

取10 mL包涵體蛋白液，7000 r/min 4℃離心10min后，沉淀溶于4 mL結合液中，上柱與Ni-Agarose介質結合2 h，結合液洗柱3次后分別用40、60、80、100、150、200、300、400、500 mmo1/L咪唑洗脫結合蛋白，SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

1.6不同濃度飽和硫酸氨純化包涵體蛋白

取9管1 mL包涵體蛋白液，震蕩滴加飽和硫酸氨，使飽和硫酸氨終濃度分別為10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，置4℃冰箱2 h后7000 r/min，4℃離心10 min，沉淀用1 mL PBS溶解后加飽和硫酸氨液體使其終濃度達到上述濃度進行沉淀，反復3次溶解、沉淀后，沉淀溶于1 mL PBS中，SDS-PAGE電泳檢測其純化效果。

2　結果

2.1差速離心純化

EV71 VP1重組質粒誘導表達前在33 kD處未見蛋白表達帶；誘導表達6 h后在33 kD處可見一條高濃度的蛋白表達帶，且雜蛋白較多；經反復差速離心純化獲得的蛋白，其純化效果較好，僅在33 kD處有一條高濃度的蛋白帶，無雜蛋白帶，但目的蛋白損失較多，其得率僅為1%。見圖1。

圖1　包涵體表達蛋白差速離心純化結果

2.2包涵體純化試劑純化

IMAC柱純化效果較好，其中150 mmo1/L咪唑溶液洗脫效果最好，獲得的純化蛋白濃度最高。因洗脫的蛋白液含不同濃度的咪唑會對SDS-PAGE電泳產生影響導致Marker跑偏，且咪唑洗脫蛋白電泳結果比用PBS稀釋的蛋白分子量小。見圖2。

圖2　不同濃度咪唑洗脫包涵體蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3不同濃度飽和硫酸氨純化

將包涵體蛋白分別用不同濃度的飽和硫酸氨純化，摸索純化最佳條件，包涵體蛋白會隨著飽和硫酸氨濃度的增加損失增多，而雜蛋白含量無明顯變化。見圖3。

圖3　不同濃度飽和硫酸氨純化EV71-VP1蛋白SDS-PAGE電泳圖

3　討論

原核蛋白表達系統是目前最常用的蛋白表達系統，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和分離純化表達產物相對簡單等優點，但仍存在表達外源蛋白易形成包涵體的問題，其原因主要為：①蛋白合成速度太快導致新生多肽無法折疊；②缺少糖基化等修飾使蛋白中間體大量積累形成包涵體；③培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素導致包涵體形成；④大腸桿菌不易形成二硫鍵，而二硫鍵在蛋白折疊中有重要作用。但因包涵體蛋白表達水平高、相對較純且易分離純化等優點，包涵體蛋白表達仍在商業化生產中得到廣泛應用。

本研究從前期EV71 VP1重組基因VP1蛋白表達入手，摸索了很多表達條件[溫度、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導劑（Isopropy1 β-D-1-thioga1actopyranoside，IPTG）不同濃度的摸索等]均不能獲得EV71 VP1蛋白的可溶性表達。隨后，為探索包涵體蛋白的純化方法，本研究從本室制備的包涵體入手，分別嘗試了3種純化包涵體蛋白方法，希望從中找出快速、高效的純化方法為后續研究提供幫助。結果顯示差速離心法可大批量的純化包涵體蛋白，純化效果較好，可用于動物免疫需大批量蛋白時用。但該純化法存在蛋白損失較多、純化蛋白不能反復凍融的問題，目前主要通過小量分裝凍存來避免。IMAC柱純化法純化效果較好，純化蛋白性狀穩定，適用于試劑盒方法學的研究[19-20]。但該法仍存在純化柱較貴，且每次只能純化少量包涵體蛋白，純化蛋白需透析脫鹽處理，易造成蛋白變性、濃度降低，特別是在動物免疫時不能滿足要求等問題[6]。不同濃度飽和硫酸氨純化法無法獲得純度較高的包涵體蛋白。

[1]Franke1 S，Sohn R，Leinwand L.The use of sarkosy1 in generating so1ub1e protein after bacteria1 expression[J].Proc Nat1 Acad Sci USA，1991，88（44）：1192-1196.

[2]Vi11averde A，Carrio M.Protein aggregation in recombinantbacteria：bio1ogica1 ro1e of inc1usion bodies[J].Biotechno1 Lett，2003，25（17）：1385-1395.

[3]Ventura S.Sequence determinants of protein aggregation：too1s to increase protein o1ubi1ity[J].Microb Ce11 Fact，2005，4（1）：11-18.

[4]王增，馬會勤，張文，等.包涵體蛋白的分離和色譜法體外復性純化研究進展[J].中國生物工程雜志，2009，29（7）：102-107.

[5]凌明圣，許祥裕，丁樹標.以包涵體形式存在的重組蛋白的純化和體外折疊[J].中國生化藥物雜志，1995，16（3）：135-139.

[6]羅惠霞，李敏，王玉炯.包涵體蛋白復性的幾種方法[J].生物技術通報，2007，23（5）：96-98.

[7]SheehanD.Fastprotein1iquidchromatography（FPLC）methods[J].Methods Mo1 Bio1，1996，59：269-275.

[8]Benjamin S，Anna S，Ernst H，et a1.Use of anionic denaturing detergents to purify inso1ub1e proteins after over expression[J].BMC Biotechno1，2012，12：1-7.

[9]Mosadeghi P，Heydari Zarnagh H，Mohammad-Zadeh M，et a1.High-1eve1 so1ub1e expression and one-step purification of HTLV-I P19 protein in escherichia co1i by fusion expression[J].Iran J A11ergy Asthma Immuno1，2015，14（6）：624-632.

[10]Okegawa Y，Koshino M，Okushima T，et a1.App1ication of preparative disk ge1 e1ectrophoresis for antigen purification from inc1usion bodies[J].Protein Expr Purif，2016，118：77-82.

[11]Zhong Y，Lin1in Z，Yan Z，et a1.High1y Efficient Production of So1ub1e Proteins from Inso1ub1e Inc1usion Bodies by a Two-Step-Denaturing and Refo1ding Method[J]. PLoS One，2011，6（7）：1-8.

[12]Escar1ata Rodríguez-Carmona，O1ivia Cano-Garrido，et a1. Iso1ation of ce11-free bacteria1 inc1usion bodies[J].Microb Ce11 Fact，2010；9：1-9.

[13]陸健.蛋白質純化技術及應用[M].北京：化學工業出版社，2005：120-145.

[14]胡燕，白冰珂，沈宏輝，等.腸道病毒71型強神經毒分離株VP1蛋白的表達鑒定[J].實用預防醫學，2012，19（11）：1615-1617.

[15]Parkar AA，Stow MD，Smith K，et a1.Large-sca1e expression，refo1ding，and purification of the cata1ytic domain of human macrophage meta11oe1astase（MMP-12）in Escherichia co1i[J].Protein Expr Purif，2000，20（2）：152–161.

[16]李曉楠，趙忠鵬，段躍強，等.EV71型VP1蛋白表達、純化及免疫原性的初步評價[J].免疫學雜志，2010，26（3）：187-190.

[17]謝維欣，武建明，李杰，等.腸道病毒71VP1基因的原核表達及其抗血清的制備[J].免疫學雜志，2013，29（1）：38-42.

[18]張立懷，張國中，霍蕾，等.檢測禽流感病毒抗原的雙抗體夾心ELISA方法的建立[J].中國醫藥生物技術，2009，4（1）：62-64.

[19]Chen HL，Huang JY，Chu TW，et a1.Expression of VP1 protein in the mi1k of transgenic mice：a potentia1 ora1 vaccine protects against enterovirus 71 infection[J].Vaccine，2008，26（23）：2882-2889.

[20]周伯平，劉威龍，謝靖婧，等.腸道病毒71型重組VP1蛋白的表達和EV71型手足口病血清學診斷方法的建立[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2008，22（6）：492-494.

Comparison of three methods for purification of inclusion body protein

CHAI Yantao*JIANG Qiyu*XIE GuomingHU YanWU ShunquanYANG RuichuangMAO PanyongHOU Jun▲
Research Center for C1inica1&Trans1ationa1 Medicine,302 Mi1itary Hospita1 of China,Beijing100039,China

R392.33

A

1673-7210（2016）04（a）-0004-03

國家自然科學基金資助項目（81271846）。*共同第一作者

▲

（2015-11-25本文編輯：趙魯楓）