用于羊草基因分型的SNP分子標記技術研究

侯莉娟，齊　曉，齊冬梅，陳雙燕*，劉公社*（.中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室，北京00093；2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古呼和浩特0000；3.全國畜牧總站，北京0025）

用于羊草基因分型的SNP分子標記技術研究

侯莉娟1**，齊曉2，3**，齊冬梅1，陳雙燕1*，劉公社1*
（1.中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室，北京100093；2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古呼和浩特010010；3.全國畜牧總站，北京100125）

以我國廣泛分布的多年生優勢禾本科牧草羊草為研究材料，針對羊草目前尚無SNP標記技術的報道，基于實驗室已有的轉錄組數據，挖掘其中的SNP分子標記，建立一種利用高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）進行羊草SNP基因分型的方法。結果表明，從羊草轉錄組數據中獲得41843個SNPs，轉換的數量是顛換數量的2倍；建立了基于SNP的HRM基因分型方法，設計了112對SNP引物，其中有98對（87.5%）能擴增出明亮單一條帶，擴增條帶大小符合預期的有72對（64.29%），適宜進行HRM基因分型的引物有46對，占41.07%；用其中的7對引物可將羊草48份種質區分開，并繪制出指紋圖譜。通過對部分HRM基因分型結果進行測序驗證，表明測序分析的基因型結果與HRM基因分型結果一致，證明HRM基因分型結果是可靠的。本研究首次建立的基于SNP的HRM基因分型方法，可用于羊草種質資源的指紋圖譜繪制、育種親本的選配、基因關聯分析、分子標記輔助育種、功能分子標記開發、新品種的保護等育種工作。

羊草；轉錄組；SNP標記；HRM基因分型；指紋圖譜

http：//cyxb.lzu.edu.cn

侯莉娟，齊曉，齊冬梅，陳雙燕，劉公社.用于羊草基因分型的SNP分子標記技術研究.草業學報，2016，25（2）：105-113.

HOU Li-Juan，QI Xiao，QI Dong-Mei，CHEN Shuang-Yan，LIU Gong-She.A study of SNP molecular marker technology for Leymuschinensis genotyping.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：105-113.

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）指在個體基因組上任何一個核苷酸的變異形成的DNA序列多態性［1］。與其他分子標記（如SSR）相比［2］，SNP分子標記具有明顯的優勢。SNPs數量多，分布廣泛，多態性豐富，密度高。在植物基因組內，平均每21 bp就出現一個SNP。一般只有兩種堿基組成，是二等位基因，只需+/-的分析，適于快速、規模化篩查基因組。某些位于基因內部的SNP有可能直接影響蛋白質結構或表達水平。SNP等位基因頻率容易估計，易于基因分型，遺傳穩定性比SSR高，能夠進行高通量自動化基因分型檢測［3-5］。因此，SNP被認為是應用前景最好的遺傳標記之一。

隨著新一代測序技術的發展，轉錄組測序已經成為鑒定非模式植物SNP多態性分子標記的重要數據源。基于轉錄組挖掘SNP分子標記具有顯著的優點，因為這些SNP變異位于功能基因上，可能直接與植物表型相關。目前基于轉錄組測序開發SNP標記已在水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）等作物以及苜蓿（Medicago sativa）、高羊茅（Festuca arundinacea）和白三葉（Trifolium repens）等牧草中廣泛開展，開發的SNP被廣泛應用于遺傳圖譜構建和遺傳多樣性分析中［6-13］。高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）是在PCR基礎上通過測定DNA雙鏈熔解曲線變化來檢測SNP變異的方法。HRM操作簡便，在PCR結束后添加LC Green染料，通過監測升溫過程中熒光染料與PCR擴增產物的結合情況來實現的，在升溫過程中，雙鏈解開，熒光染料從解鏈的分子上釋放，同時熒光強度降低，所以通過熒光強度和曲線的變化上就可以進行SNP基因分型。該方法高度靈敏、簡單有效［14］，已經在多倍體苜蓿、多年生黑麥草（Lolium perenne）、土豆（Solanum tuberosum）等物種中應用，進行基因分型和定位性狀［5，15-16］。

羊草（Leymus chinensis）是我國廣泛分布的具有優勢的多年生禾本科牧草，目前在種質資源的精細評價和創新利用方面還比較薄弱，亟須采用新一代SNP分子標記技術對這些豐富的資源進行精細評價，以便發掘其中有價值的資源，加速牧草育種工作進程。針對羊草目前尚無單核苷酸多態性SNP標記技術的報道，本研究基于實驗室建立的羊草轉錄組數據，挖掘其中的SNP分子標記，首次建立了一種基于SNP標記的HRM分析方法，用于羊草種質資源的基因分型和精細評價。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用到的羊草材料取自中國科學院植物研究所羊草種質資源圃，于2014-2015年進行實驗。

1.2藥品和試劑

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒購自北京博邁德基因技術有限公司；PCR擴增kit購自北京全式金公司；LC Green飽和熒光染料（美國Idaho公司，貨號BCH M-ASY-0005），購自思博全科技有限公司；Light Scanner專用礦物油為Sigma公司產品；p MD19-T simple載體購自Ta KaRa公司。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程上海（股份）有限公司；引物合成和克隆測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；其他所用普通化學試劑均為國產分析純。

1.3方法

1.3.1發掘羊草SNP根據實驗室前期獲得的羊草轉錄組數據，包含了豐富的組織器官和各種脅迫處理的材料［17-20］。采用生物信息學技術發掘羊草SNP，首先使用BWA軟件將所有Clean reads定位到87214條Uni-gene上，然后利用samtools去call SNP，BWA和samtools均使用軟件推薦的參數［21］。

1.3.2設計SNP引物根據生物信息學分析發掘的SNP位點，利用DNAMAN軟件設計SNP引物。具體方法如下：首先確定SNP位點所在序列的方向，如果序列是反向的，需要進行反向互補，然后與水稻基因組（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）進行BLASTN比較，確認序列的結構，避免擴增片段跨越兩個外顯子。在SNP位點的上下游分別設計正向引物和反向引物，引物設計的參數為引物長度18～24 bp；Tm 62～66℃，盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般不超過2℃；GC含量40%～60%，45%～55%最佳；產物大小為50～200 bp。

1.3.3建立高分辨率熔解曲線方法該方法的建立包括以下條件的摸索：篩選有效擴增的SNP引物對，確定HRM-PCR反應體系與程序，確定適宜的DNA模板，分析LC Green染料是否對PCR擴增有影響，優化HRM熔解曲線分析。具體步驟為：首先在PCR擴增儀（Bio-Rad T100）上進行PCR反應，之后在反應體系內加入LC Green飽和熒光染料，并在PCR儀內進行1 min短暫的錯配反應，然后將PCR產物（96/孔板）插入LightScanner儀器上進行HRM分析。

1.3.4HRM用于羊草種質基因分型利用建立的HRM方法對48份羊草種質材料進行基因分型。具體步驟如下：以羊草基因組DNA為模板，采用待檢測SNP引物進行PCR擴增。PCR反應體系10μL：40 ng模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、400μmol/L d NTPs、0.5 U TaqDNA聚合酶、1μmol/L引物及10×PCR buffer。PCR反應程序：94℃預變性2 min；然后94℃變性30 s，72℃復性30 s，72℃延伸30 s（復性溫度從72℃到58℃每個循環降落1℃），然后進行30個循環94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。之后在PCR擴增產物中加入1μL LC Green，然后進行95℃30 s，25℃30 s。此程序結束后，將反應產物放在Light-Scanner儀器上進行HRM分析，對羊草不同種質進行基因分型。

1.3.5測序驗證HRM分型結果選擇HRM熔解峰和熔解曲線較理想的部分SNP引物對擴增產物進行測序，以驗證HRM分型結果是否可靠。具體步驟如下：將待測序SNP引物的HRM不同基因分型的PCR產物連接到p MD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，利用ABI 3730測序儀進行測序，根據測序峰圖和等位基因出現的頻率確定基因型，并與HRM基因分型結果進行比較，以驗證引物基因分型的準確性。

表1　羊草SNP類型及引物設計情況Table1　Various types of SNP and designed primers in L.chinensis

2　結果與分析

2.1從羊草轉錄組數據中發掘SNP

通過對羊草轉錄組數據進行生物信息學分析，如表1所示，共獲得41781個SNPs，其中堿基顛換（transversion，即嘌呤與嘧啶之間的替代）有8種形式（AC/AT/CA/CG/GC/GT/TA/TG），共計13053個；轉換（transition，即嘌呤與嘌呤，或嘧啶與嘧啶之間的替換）有4種形式（AG/GA/CT/TC），共計28728個；轉換的數量約是顛換的2倍，符合一般規律。在8種形式顛換和4種形式轉換SNP變異中各選取一些SNP位點設計引物，共設計了112對引物，包含112 個SNP位點。

2.2建立HRM分析方法

2.2.1PCR體系和擴增程序HRM基因分型對模板DNA比較敏感，為了保證模板DNA的均質化，本實驗所有DNA樣品采用統一試劑盒提取和純化，然后將所有DNA的濃度調至統一的標準濃度（本研究以濃度40 ng/μL為標準）。結果發現DNA濃度在40～120 ng/μL的范圍內都能擴增出清晰明亮的條帶。為了節省DNA量，達到多次使用的目的，將PCR反應體系中DNA模板濃度設定為40 ng/μL。PCR反應體系中引物濃度為1μmol/L，與常規PCR要求的一致，但是對于個別引物，擴增產物中如果有引物二聚體或非特異性擴增條帶，則將引物濃度降低至0.25μmol/L，可降低引物二聚體。

由于各引物對的Tm值和適宜退火溫度不一致，摸索每對引物的適宜退火溫度比較繁瑣，同時為了提高實驗效率，需要確定一個廣譜穩定的PCR擴增程序，適合所有引物對的擴增。本研究經過摸索，設定了15個循環的降落PCR，退火溫度每個循環降落1℃，從72℃降落到58℃，之后在58℃的退火溫度下再進行30個循環的擴增比較合適（圖1），擴增產物清晰明亮，提高了引物的擴增效率。

2.2.2SNP引物對的篩選為了驗證所合成的SNP引物對能否擴增出目的條帶，對其進行了PCR擴增及電泳檢測，結果如表2所示。112對SNP引物中，能夠擴增出清晰明亮單一條帶的引物有98對，占87.5%；其中，擴增條帶大小符合預期的引物有72對，占64.29%。然后對72對引物進行HRM分析，以便篩選出能夠用于HRM基因分型的SNP引物對。通過觀察HRM的熔解曲線和熔解峰，發現HRM熔解曲線有明顯拐角，熔解峰高聳、單一的引物可以用于HRM分析（圖2），共挑選出46對引物可用于HRM基因分型（表2）。

圖1　循環數對PCR擴增產物的影響Fig.1　Effect of cycle number to PCR products

圖2　可用于HRM分析的SNP引物的熔解曲線和熔解峰示例Fig.2　Example of melting curves and melting peaks of SNP primer pairs for HRM analysis

表2　SNP引物對的篩選Table2　Screening of SNP primer pairs

2.2.3LC Green對PCR擴增的影響為了檢驗LC Green染料對PCR擴增是否有影響，以確定加入染料的時間點，本研究設置了4個PCR反應，即不加模板對照（A）不加染料（B）、PCR反應之前加染料（C）和PCR反應之后加染料（D），4個PCR反應同時進行，只是在染料添加的順序上有區別。結果表明（圖3），“B”管和“D”管的電泳結果均可看到清晰明亮的條帶，而PCR反應之前加染料“C”管的條帶消失。說明PCR反應前加入LC Green染料對PCR擴增結果有影響。因此，LC Green應該在PCR反應結束之后加入，然后在PCR儀中進行錯配反應（95℃30 s；25℃30 s）。

2.2.4LightScanner檢測時熔解溫度范圍的設定

在運行HRM檢測前，需要選擇熔解溫度范圍，儀器默認設置為65～95℃。但是對于某些引物對來說，如果將95℃設定為右邊界，熔解峰還沒有繪制完，反應就結束了。對于這樣的引物對，需要增大熔解溫度右邊界的值，保證熔解峰的完整和分析的可靠性。儀器的最大溫度為98℃，因此在HRM分析時，可以將熔解溫度范圍設定的盡量大一些（設定為65～98℃），以保證所有引物對的熔解峰都能繪制完全。圖4所示為兩對代表性引物的熔解峰，A代表了絕大多數引物對的HRM熔解峰情況，在儀器默認熔解溫度范圍內，而B代表了個別引物對熔解峰出現較晚的情況。

圖3　LC Green對PCR擴增產物的影響Fig.3　Effects of LC Green on PCR amplicons

圖4　兩對代表性引物對12個DNA進行HRM分析的熔解峰Fig.4　Melting peaks of the two representative primer pairs for HRM analysis to 12 DNAs

2.3基于SNP的HRM對羊草種質基因分型

利用上述篩選的46對HRM引物對，利用其中7對引物（代表基因分型少，4組；基因分型中等，5～7組；基因分型較多，8組）對羊草48個種質進行了基因分型，結果表明使用這7對引物就可以將羊草48個種質區分開，繪制出指紋圖譜。如圖5所示，不同引物對的分型結果用不同的顏色區分；同一引物對的分型結果用數據條長短區分，數據條長度相同的種質，基因型一致，數據條長度不同的種質，表明在基因分型時被分到不同的組別。舉例來說，YC1和YC2兩份種質，除了SNP42引物變異位點存在差異之外，其余6個SNP引物變異位點均沒有差異，表明這兩份種質的差異較小；而YC22和YC23兩份種質，7個SNP引物的變異位點均存在差異，表明它們的差異較大。

圖5　利用7對SNP引物對羊草48個種質繪制的指紋圖譜Fig.5　Fingerprints of 48 L.chinensis DNA using 7 SNP primer pairs

2.4測序驗證HRM分型結果

根據上述HRM分型結果，挑選了3對代表性SNP引物，對其擴增產物進行測序以驗證HRM分型結果。從每對引物的每個分組（代表一個基因型）中挑選一個樣品進行測序，通過對測序克隆峰圖的分析及克隆間的序列比對，統計SNP位點的堿基及其頻率，確定其對應的基因型。測序結果發現（表3），除了目標SNP位點的變異外，還出現了其他位點的SNP變異；對每對引物所擴增產物的SNP變異位點基因型進行分析，發現不同羊草種質的基因型都不一致，這與HRM分型結果一致。以SNP2為例，HRM將羊草種質YC3，YC5和YC12分型到a，b和c組中，而測序結果表明，3個種質的目標位點67基因型一致，但其他變異位點63和69的基因型有差異。因此，測序數據證明HRM分型結果是可靠的。

表3　3對引物擴增產物SNP變異位點的基因型Table3　Genotypes of SNP mutation sites f rom the amplified products of three primer pairs

3　討論

近年來隨著高通量測序技術的飛速發展，各類生物信息學軟件的開發，使得SNP分子標記的開發更便捷。對于多倍體或沒有參考基因組的物種來說，利用新一代高通量轉錄組測序技術可大量鑒定SNP［22］。目前，利用轉錄組測序技術已經在水稻、玉米、高粱、大麥和小麥等農作物以及苜蓿、高羊茅和白三葉等牧草中鑒定到大量的SNP［6-13］。本研究通過生物信息學分析從羊草轉錄組測序數據中挖掘出41843個SNPs，表明轉錄組測序是從多倍體非模式植物中獲得大量SNP的有效方法。

HRM分析是一種快速掃描PCR擴增產物內SNP變異的高度靈敏、簡單有效的方法［14］。該技術已經成功應用于同源四倍體植物苜蓿和土豆的SNP基因分型和多態性檢測，并且在發現變異、分析候選基因、比較和關聯定位的基因分型等育種工作中也有很好地應用潛力［5，16］。本研究利用羊草轉錄組中發掘的SNP，在SNP引物的設計，HRM-PCR反應體系與程序，LC Green染料對PCR擴增的影響，HRM熔解曲線分析等方面進行了摸索與優化，建立了基于EST-SNP的羊草HRM分型方法，與前人研究相比［5，16］，本研究最大的特點是確定了一個廣譜穩定的PCR擴增程序，提高了實驗效率，并且利用HRM分析成功對羊草進行了SNP基因分型，通過測序驗證HRM分型是可靠的。

大型機械壓力機大多為二到三級傳動結構，第一級為電動機通過皮帶帶動主軸轉動，第二級為主軸上的小齒輪帶動曲軸上的大齒輪轉動。從而通過曲柄滑塊機構驅動滑塊作上下往復的直線運動。因此大型機械壓力機傳動系統噪聲主要是齒輪副的噪聲。

羊草是異源四倍體，假設基因內某一位點的堿基出現變異，例如C突變成T，則這一位點理論上有5種基因型：CCCC、CCCT、CCTT、CTTT、TTTT。因此對于有1個SNP變異位點的引物對來說，其擴增產物在SNP位點的基因型理論上是5種。如果一對SNP引物有2個SNP變異位點（每個變異位點理論上有5種基因型），理論上能區分52=25個羊草基因型。本研究通過測序發現，SNP2、SNP14和SNP41引物對擴增產物中，除了轉錄組數據中發掘的目標SNP位點外，還有其他SNP變異位點，分別有3，4和7個SNP變異位點，因此，理論上可以區分53，54和57個羊草基因型。但是，由于受供檢測的羊草基因型的限制，以及HRM軟件最大分組的限制（最高分組為8組，超過8組的基因型被分在未知組中），HRM實際基因分型能力遠遠沒有達到理論水平。隨著HRM軟件的改進，該技術在基因分型能力上可大大提高。

SNP在育種中的應用非常廣泛，包括遺傳多樣性分析、等位基因挖掘、高分辨率遺傳連鎖圖譜構建、QTL定位、標記輔助選擇、品種鑒定等。本研究所獲得的SNP來源于羊草轉錄本，對應基因，可利用這些SNP與田間表型性狀進行關聯分析，發現與重要性狀關聯的SNP標記。還可以用來進行羊草親本選配、發展功能分子標記、用于羊草分子標記輔助育種、構建指紋圖譜及用于羊草育成新品種的保護等，從而推進羊草分子育種工作的進程。

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［2］張麗君，劉龍龍，暢志堅，等.草業學報，2015，24（7）：146-154.

A study of SNP molecular marker technology for Leymus chinensis genotyping

HOU Li-Juan1**，QI Xiao2，3**，QI Dong-Mei1，CHEN Shuang-Yan1*，LIU Gong-She1*
1.Key Laboratory of Plant Resources，Institute of Botany，The Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093，China；2.Institute of Grassland Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Hohhot 010010，China；3.National Animal Husbandry Service，Beijing 100125，China

Leymus chinensis，is a widely distributed and often ecologically dominant perennial grass in China，frequently used as research material.Because we know of no previous reports of markers in L.chinensis，we performed single nucleotide polymorphism（SNP）mining of 48 genotypes，based on the transcriptome data in the laboratory and established a method using high resolution melting（HRM）curves for L.chinensis SNP genotyping.A total of 41843 SNPs were detected from the transcriptome data by bioinformatics analysis. Transitions were nearly twice as frequent as transversions.Among 112 pairs of designed SNP primers，98 SNP primer pairs（87.5%）were able to amplify bright single bands，72 primer pairs（64.29%）had a suiTableamplified band size，and 46 SNP primer pairs（41.07%）were suiTablefor HRM genotyping.The 48 germplasm genotypes of L.chinensis could be separated by 7 primer pairs and the fingerprint of each identified.The partial HRM genotyping results were verified by sequencing.The results of genotype by sequencing analysis were consistent with the results of HRM genotyping，so confirming that the HRM genotyping was reliable.HRM for SNP genotyping first established in this study can also be used in other breeding work with L.chinensis，including parent selection，gene correlation analysis，molecular marker assisted breeding，development of functional molecular markers and new variety protection.

Leymus chinensis；transcriptome；SNP marker；HRM genotyping；fingerprint

10.11686/cyxb2015466

2015-09-29；改回日期：2015-10-26

國家草品種區域試驗項目-羊草新品種“三性”測試（農財發［2015］36號）和國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2014CB138704）資助。

侯莉娟（1989-），女，山西太原人，碩士。E-mail：jennifer＿hou762@163.com。齊曉（1982-），男，河北泊頭人，碩士。E-mail：tq07mms @sina.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

Corresponding author.E-mail：sychen@ibcas.ac.cn，liugs@ibcas.ac.cn