內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發的影響

曠　宇，南志標，田　沛（草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發的影響

曠宇，南志標，田沛*
（草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

本試驗以帶Epichloё內生真菌（E+）及不帶內生真菌（E-）中華羊茅種子為研究材料，研究其水引發后，在NaCl脅迫條件下的萌發情況。結果表明，NaCl脅迫顯著降低中華羊茅種子發芽率、發芽勢、發芽指數、胚芽長、胚根長和干重。除對照處理外，相對于不帶內生真菌的中華羊茅種子，內生真菌能顯著提高不同NaCl濃度脅迫條件下中華羊茅種子的萌發力及幼苗生長。水引發與內生真菌可產生互作，在引發時間為20 min時與內生真菌的互作效果最為明顯，在不同NaCl濃度脅迫下中華羊茅種子各萌發指標及幼苗生長情況均顯著高于其他處理。在對各指標的相關性分析顯示，中華羊茅種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、胚芽長、胚根長和干重相互之間均呈極顯著正相關。

水引發；NaCl脅迫；Epichloё內生真菌；中華羊茅

http：//cyxb.lzu.edu.cn

曠宇，南志標，田沛.內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發的影響.草業學報，2016，25（2）：160-168.

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在全球干旱或半干旱地區上分布著大面積的鹽漬化土壤，由于其對植物生長具有較強的抑制作用。土壤鹽澤化已成為當地農作物生產上的一個主要限制因素［1］。在我國，有大約1億hm2的耕地因受到鹽漬化的影響而不適宜農業生產，逐步成為撂荒地，不僅造成耕地面積的減少，而且給當地的生態環境帶來不可挽回的損失［2］。雖然土壤鹽漬化現象普遍存在，但是隨著前人研究的不斷深入，發現其在空間和時間上卻存在著高度的可變性［3］。因此，除了對傳統的鹽澤化土壤改良方法及耕作方式進行改進外，在一些地區選用高耐鹽植物品種對農牧業生產及土壤改進行良，這為鹽澤土壤種植提供了一種可行性較高的策略［4］。

中華羊茅（Festuca sinensis）是禾本科羊茅屬多年生疏叢型草本植物，多分布在西藏、青海、甘肅、四川等地，具有抗寒耐旱、耐鹽堿等優良特性，現已逐步成為高寒牧區草地生產的優良栽培牧草［5］。1996年南志標對采自甘肅夏河的中華羊茅內生真菌進行檢測，發現其禾草內生真菌侵染率近乎100%。此后，研究者們對中華羊茅內生真菌共生體的研究興趣就在不斷增加。

禾草內生真菌（grass endophyte）一般是指寄生在禾草體內渡過全部或大部分生活周期，而禾草本身不顯示任何外部癥狀的一大類真菌［6］。內生真菌菌絲體通常分布在宿主禾草葉鞘、莖稈、根狀莖的細胞間隙，少量分布在宿主禾草葉片表面［7-10］。內生真菌與其宿主禾草形成的共生體具有較為穩定的互惠共生關系，其主要表現在禾草能為內生真菌提供營養、庇護之地和傳播媒介；而內生真菌可以通過提高宿主對生物［11-13］和非生物［14-17］脅迫的適應性來提高其生存能力。有關禾草-內生真菌共生體的研究多集中在黑麥草（Lolium perenne）、高羊茅（Festuca arundinacea）、草甸羊茅（Festuca peatensis）、醉馬草（Achnatherum inebrians）、披堿草（Elymus dahuricus）等宿主禾草上，同時對于中華羊茅-內生真菌共生體的研究也在不斷的增加［18］。其中金文進等［19］就對分離來自不同種群的中華羊茅內生真菌的生物學和生理學特性進行了研究，發現分布在中華羊茅不同種群的禾草內生真菌存在著豐富的多樣性。楊洋［20］對內生真菌提高中華羊茅的抗寒性進行了初步研究，隨后彭清青［21］對內生真菌提高中華羊茅抗寒性的生理生化機制進行了較為詳細的研究，發現內生真菌能及時誘導中華羊茅生理生化代謝發生變化，進而保護其免受凍害的威脅。姚祥等［22］篩選得到了中華羊茅內生真菌的最適殺菌劑及其濃度，為研究者提供了較好的借鑒。對中華羊茅種子的研究發現，相對于不帶內生真菌的中華羊茅，內生真菌在一定的p H值范圍內能顯著提高中華羊茅種子的發芽勢、發芽率、胚芽長、胚根長及干重。此外，Peng等［23］研究表明，水引發條件下，內生真菌可以提高宿主植物抗寒和抗旱作用，在一定時間的水引發條件下可以和內生真菌進行較好的互作。水引發是在控制給水條件下使種子定量吸水，從而達到促進萌發但并不引起傷害的一種浸種技術［24］。對許多植物種子的水引發研究結果表明，水引發是通過改變和調控種子內部的生理生化活動與過程，增強種子活力、縮短萌發時間、增強幼苗早期的抗性和提高萌發率［25-26］。然而，有關水引發和內生真菌互作是否可以提高中華羊茅對其他非生物脅迫的抗性尚未見報道。為此，我們以帶菌及不帶菌中華羊茅種子為研究對象，在水引發處理下研究中華羊茅種子萌發及幼苗生長對NaCl脅迫的響應，從而為中華羊茅-內生真菌共生體的應用研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1種子來源

中華羊茅種子于2013年9月采自甘肅省夏河縣桑科草原（N：35°12′，E：102°31′；海拔：3009 m），對采集到的中華羊茅單株分別進行帶菌率的檢測，參照姚祥等［22］的方法建立帶菌（E+）和不帶菌（E-）中華羊茅種子，低溫儲存備用。

1.2研究方法

1.2.1種子的水引發處理參照Taylor等［27］的方法，分別稱取80 g E+和E-種子，用75%的酒精消毒1 min，滅菌的蒸餾水沖洗3遍，然后用1%的次氯酸鈉處理5 min，滅菌的蒸餾水沖洗3遍。然后分別稱取10 g E+和E-種子放入4個12 cm的滅菌培養皿中，加入30 m L的滅菌蒸餾水，分別浸泡20和40 min，重復3次。其余的E+和E-種子作為對照（即處理了0 min）。

1.2.2NaCl脅迫處理參照王玉萍等［28］的方法采用紙上萌發試驗，分別挑取上述飽滿的E+和E-種子放入以滅菌的濾紙作為芽床的9 cm滅菌培養皿中，每皿50粒種子。分別加入50，100，150，200 mmol/L的NaCl溶液各6 m L，將加入6 m L滅菌蒸餾水的作為對照，每一個處理均為4個重復。將培養皿放在30/20℃（8 h高溫/16 h低溫）培養箱中黑暗培養。記錄種子萌發數、胚芽長、胚根長、幼苗干重，并計算發芽率、發芽勢和發芽指數。

式中，DG為逐日發芽數，DT為相應DG的發芽天數。

1.3數據處理

將所得的數據錄入Excel 2007，計算發芽勢、發芽率和發芽指數，用SPSS 19.0軟件對所得到的數據分別采用one-way ANOVA進行統計分析，得出各處理下所測指標的差異性分析，用平均值±標準誤表示測定結果。同時運用SPSS 19.0軟件對所測指標進行相關性分析，制表。

2　結果與分析

2.1內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽勢和發芽率的影響

在50～200 mmol/L濃度的NaCl脅迫條件下內生真菌和水引發均能不同程度的提高中華羊茅的發芽率和發芽勢。中華羊茅種子發芽勢和發芽率隨著NaCl濃度的增加而逐漸下降，同時隨著引發時間的增長二者均出現先上升后下降的趨勢，在引發20 min時發芽勢和發芽率均達到最大（表1，表2）。

隨著NaCl脅迫濃度的增加，各處理條件下中華羊茅種子的發芽勢及發芽率均呈現下降趨勢，但是相比對照，在低濃度下（50 mmol/L）各處理發芽勢差異并不顯著（P＞0.05），在中度（100 mmol/L）及重度脅迫條件下（150、200 mmol/L）其發芽勢顯著低于低濃度NaCl脅迫。在低濃度NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽率與對照差異并不顯著（P＞0.05），但是在中度及重度脅迫條件下，其發芽率顯著（P＜0.05）低于對照及低濃度脅迫，這說明在一定濃度脅迫條件下中華羊茅對NaCl脅迫具有一定的抗逆性。

在對照及50～200 mmol/L的NaCl濃度脅迫下，帶內生真菌中華羊茅種子（E+）發芽勢及發芽率均顯著高于不帶內生真菌種子（E+）（P＜0.05），說明內生真菌可顯著提高中華羊茅種子的發芽勢及發芽率。在各濃度NaCl脅迫條件下，當水引發時間為20 min時，中華羊茅發芽勢及發芽率均高于不進行引發處理及引發時間為40 min的處理，引發時間為40 min時中華羊茅的發芽勢及發芽率與對照差異不顯著（P＞0.05），在引發時間為20 min時，帶內生真菌種子發芽勢及發芽率均顯著（P＜0.05）高于其他處理。

表1　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽勢的影響Table1　The interim germination of F.sinensis seeds under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydro-priming %

表2　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽率的影響Table2　The germination rate of F.sinensis seeds under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming %

2.2內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽指數的影響

各處理條件下，中華羊茅發芽指數隨著NaCl濃度的增加而逐漸下降（表3）。在低濃度及中濃度NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽率與對照差異不顯著（P＞0.05），當NaCl濃度達到150及200 mmol/L時，中華羊茅發芽指數顯著低于其他處理及對照（P＜0.05）。不同水引發及NaCl濃度的脅迫條件下，帶內生真菌中華羊茅種子發芽指數均顯著高于不帶內生真菌的種子（P＜0.05）。水引發時間為20 min時，中華羊茅種子發芽指數明顯高于對照及引發時間為40 min的處理，帶菌中華羊茅種子在引發時間為20 min時其發芽指數顯著高于其他處理條件帶菌及不帶菌種子發芽指數，引發時間為20和40 min時中華羊茅發芽指數之間差異不顯著（P＜0.05）。

表3　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子發芽指數的影響Table3　The germination index of F.sinensis seeds under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming

2.3內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子胚芽長和胚根長的影響

中華羊茅種子幼苗胚芽長和胚根長隨NaCl濃度的增加而降低（表4，表5），當NaCl脅迫濃度為50 mmol/L時中華羊茅幼苗胚芽長和胚根長與對照相比并未完全達到顯著水平，當NaCl脅迫濃度為100 mmol/L時中華羊茅幼苗胚芽長和胚根長均顯著小于對照（P＜0.05）。在50～200 mmol/L NaCl濃度脅迫下，帶菌中華羊茅幼苗胚芽長及胚根長均顯著大于不帶菌幼苗（P＜0.05）。水引發時間為40 min的各處理條件下，中華羊茅幼苗胚芽長和胚根長與對照相比差異并不明顯；而水引發時間為20 min時，帶菌中華羊茅幼苗胚芽長和胚根長均顯著大于未帶內生真菌及其他處理的幼苗（P＜0.05）。

2.4內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發干重的影響

中華羊茅幼苗干重隨NaCl濃度的增加而呈下降趨勢，各處理條件下幼苗干重主要分布在（1.27±0.02）mg～（1.71±0.04）mg（表6）。各NaCl濃度脅迫處理條件下中華羊茅幼苗干重之間差異并不明顯，當濃度大于100 mmol/L時幼苗干重顯著小于對照（P＜0.05），而NaCl濃度介于100～200 mmol/L之間時幼苗干重差異不顯著（P＞0.05）。在NaCl各濃度脅迫條件下，帶菌中華羊茅種子幼苗干重顯著高于不帶內生真菌的幼苗（P＜0.05）。水引發處理20 min時，不帶內生真菌中華羊茅幼苗干重高于其他處理，但并未達到顯著水平，然而帶內生真菌幼苗干重均顯著高于其他處理（P＜0.05）。

表4　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子胚芽長的影響Table4　The length of embryo of F.sinensis seedlings under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming mm

表5　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子胚根長的影響Table5　The length of radicle of F.sinensis seedlings under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming mm

表6　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發干重的影響Table6　The dry weights of F.sinensis seedlings under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming mg/plant

2.5內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子6個發芽指標的相關性

中華羊茅種子的發芽率與發芽勢、發芽指數、胚芽長、胚根長和干重呈極顯著相關（P＜0.01），發芽勢與發芽指數、胚芽長、胚根長和干重呈極顯著相關（P＜0.01）。發芽指數與胚芽長、胚根長和干重呈極顯著相關（P＜0.01），胚芽長、胚根長和干重呈極顯著相關（P＜0.01），胚根長和干重呈極顯著相關（P＜0.01）（表7）。

表7　內生真菌和水引發對NaCl脅迫條件下中華羊茅種子6個發芽指標的相關性Table7　The correlations between six germination indices of F.sinensis seeds under NaCl stress resulting from effects of the Epichloёendophyte and hydropriming

3　討論

內生真菌提高中華羊茅種子在NaCl脅迫下的萌發。攜帶內生真菌的野大麥（Hordeum brevisubulatum）種子在鹽脅迫條件下的發芽率、發芽指數、胚芽長和胚根長都顯著高于不帶內生真菌的種子［29］，同時內生真菌也能提高醉馬草種子的發芽率、發芽指數和胚根長［30］；這與本文的內生真菌顯著增加中華羊茅種子的發芽率、活力指數和胚根長相一致。然而Zabalgogeazcoa等［31］研究發現帶菌和不帶菌的紫羊茅（Featuca rubra）在鹽脅迫條件下沒有差異。Song等［32］發現在NaCl脅迫下帶內生真菌的野大麥的生物量明顯高于不帶內生真菌的，這與本文帶菌中華羊茅種子在各種NaCl脅迫濃度下的干重都顯著高于不帶菌的相一致，但是與任安芝等［33］發現在高鹽濃度下帶菌黑麥草生物量低于不帶菌黑麥草的研究相反。帶內生真菌的禾草在高鹽脅迫條件下的萌發顯著高于不帶內生真菌的禾草，這是因為內生真菌在高鹽脅迫條件下對宿主有增益作用。在200～300 mmol/L時，帶菌野大麥種子發芽率、胚芽長和胚根長顯著高于不帶菌的［29］。但也有人研究發現內生真菌在高鹽條件對黑麥草的分蘗沒有促進作用，Simpson和Hume［34］的研究發現高鹽濃度下內生真菌侵染對高羊茅和黑麥草的生長沒有影響。本文研究在低鹽脅迫或無脅迫條件下，帶內生真菌的中華羊茅種子胚芽長、胚根長和干重相對于未帶內生真菌的中華羊茅并未表現優勢；這與任安芝等［35］研究的內生真菌對黑麥草的分蘗數和生物量沒有促進作用相一致。

在NaCl脅迫條件下水引發能有效提高中華羊茅種子萌發及幼苗生長，當引發時間為20 min時中華羊茅種子各萌發及幼苗生長指標均明顯高于對照及40 min的水引發處理。隨著引發時間的增長，中華羊茅種子萌發及幼苗生長指標出現先升高后降低的趨勢，即：引發時間為40 min的中華羊茅發芽勢、發芽率、發芽指數、胚芽長、胚根長及幼苗干重比引發時間為20 min低，且部分指標與對照差異不顯著。本文研究發現中華羊茅種子水引發20 min為最適宜引發時間，這與Peng等［23］研究結果較為類似，其研究發現中華羊茅最適水引發時間為15～30 min。陳露［36］通過對4個商業草地早熟禾品種種子萌發及建植速度的研究發現，20℃/5 d的水引發處理能顯著提高草地早熟禾（Poa pratensis）室內萌發的發芽率、發芽指數（P＜0.05），20℃/10 d和20℃/15 d的水引發處理可顯著提高各品種的建植密度、蓋度和分蘗數，縮短了出苗天數，但是20℃/10 d處理較優。通過對6個高羊茅品種種子進行水引發處理后的萌發研究發現，適宜的水引發處理能明顯提高高羊茅種子的萌發活力，不同品種之間種子水引發的最適浸種時間和保濕時間有所不同［37］。綜上研究，中華羊茅水引發的最適時間可能在20 min左右，但是其最適引發溫度及保濕時間仍需進一步深入研究。有研究發現苜蓿（Medicago sativa）種子水引發處理后在逆境中的表現要優于適宜條件［24］，這與本研究較為類似，水引發處理后中華羊茅種子在NaCl脅迫條件下的萌發及生長情況要明顯優于對照。劉慧霞［38］也發現水引發能縮短紫花苜蓿種子到達發芽率50%的萌發時間，且提高種子的發芽指數。Carrillo等［39］發現水引發種子的發芽率比對照高40%，且發芽到50%的時間比未處理的種子減少了2 d。孫妙等［40］通過對中國沙棘（Hippophae rhamnoides）種子的水引發研究發現，在干旱及鹽脅迫條件下水引發中國沙棘種子能有效避免種子在脅迫條件下的吸脹傷害和細胞膜結構的破壞，阻止內溶物滲漏；極顯著提高引發種子可溶性糖含量，為種子萌發的啟動提供保障；極顯著降低丙二醛含量，增強種子抗氧化系統的功能；極顯著提高脯氨酸含量，增強種子的抗逆應答反應。這在較大程度上解釋了水引發促進種子在逆境條件下的萌發特性及幼苗指標的生理生化機理，為水引發實踐運用提供了較完善的理論基礎。水引發處理提高種子在逆境下的萌發，而在其生存過程中是否有包含其他的生理生化過程在內的生理生化機理以及其相關調控表達基因等分子機理仍需進一步研究。

內生真菌的侵染和水引發對中華羊茅種子的萌發及幼苗的生長具有較強的協同作用，水引發20 min帶菌中華羊茅種子各萌發指標及其幼苗生長狀況均顯著高于不帶菌中華羊茅種子和其他處理。這與Peng等［23］的研究結果較為類似，干旱脅迫條件下帶菌中華羊茅種子水引發處理后各萌發指標、幼苗生長及成株株高、分蘗、干重等均明顯高于對照及其他處理（P＜0.05）。有關禾草內生真菌提高宿主植物對非生物抗性的研究報道較為廣泛，水引發提高禾草種子萌發及其幼苗抗逆生長的研究也較為深入，但是二者之間的互作關系及其機理的研究鮮見于報道，因此相關方面的研究有待于進一步深入研究。今后在中華羊茅及其他禾草的田間栽培過程中，是否可以選育帶菌禾草種子進行水引發處理從而加強其抗逆性表現仍是一個較為復雜問題。全面分析水引發最適時間、溫度、保濕時間等因素對禾草內生真菌的影響，避免對禾草內生真菌的生長及相關抗逆次生代謝物的產生起到負面影響，以期利用禾草內生真菌改良草地栽培技術，為草地畜牧業的發展提供理論支持，為生態環境建設提供借鑒，為草地農業生態系統的穩定提供更好的服務。

4　結論

綜上所示，內生真菌能提高中華羊茅種子在NaCl脅迫條件下的萌發，主要表現在內生真菌能提高中華羊茅種子的發芽率、發芽指數和胚根長。但是在低鹽脅迫或無脅迫條件下，帶內生真菌的中華羊茅種子胚芽長、胚根長和干重相對于未帶內生真菌的中華羊茅并未表現優勢。水引發能提高中華羊茅種子的萌發同時也能有效提高其在NaCl脅迫條件下中華羊茅種子萌發及幼苗生長。通過本文的研究得出中華羊茅種子在內生真菌與水引發互作的條件下的最適水引發時間為20 min。

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Effects of Epichloёendophyte and seed hydro-priming on the germination of Festuca sinensis under NaCl stress

KUANG Yu，NAN Zhi-Biao，TIAN Pei*
State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China

This study investigated the germination and vigor of Festuca sinensis seeds infected（E+）and uninfected（E-）with Epichloёendophyte and under different levels of NaCl stress after hydro-priming.The results showed that NaCl stress treatments significantly reduced seed germination rate，interim germination，the germination index，the length of embryo and radicle and the dry weights of both E+and E-F.sinensis seeds.Compared with E-，infection with Epichloёendophyte can significantly improve germination and seedling growth of F.sinensis seeds under different concentrations of NaCl.There were interaction effects between seed hydro-priming and the Epichloёendophyte.The highest levels of interaction were with 20 mins seed hydro-priming，when the germination indices and seedling growth rates were significantly higher than for all the other treatments.Correlation analysis showed that F.sinensis seed germination rate，interim germination，germination index，the length of embryo and radicle and dry weight were all significantly positively related to each other.

hydro-priming；NaCl stress；Epichloёendophyte；Festuca sinensis

10.11686/cyxb2015143

2015-03-17；改回日期：2015-06-10

國家重點基礎研究發展規劃（973計劃）（2014CB138702）和中央高?；究蒲袠I務費專項（lzujbky-2014-76）資助。

曠宇（1989-），女，湖南攸縣人，在讀碩士。E-mail：kuangy13@lzu.edu.cn

Corresponding author.E-mail：tianp@lzu.edu.cn