驅動蛋白分子Kif14細胞內中小體定位的研究

馬 新，姜 偉，，朱長軍

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院腫瘤醫院，北京 100021；2.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387）

驅動蛋白分子Kif14細胞內中小體定位的研究

馬 新1，姜 偉1，2，朱長軍2

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院腫瘤醫院，北京 100021；2.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387）

為了探討決定人體驅動蛋白分子Kif14在細胞有絲分裂末期時定位于細胞中小體的功能域，構建了驅動蛋白分子Kif14各功能域的綠色熒光蛋白（GFP）真核細胞表達質粒，分別轉染于人體子宮頸癌細胞HeLa中.應用聚丙烯酰氨凝膠電泳和免疫印跡法（WesternBlot）檢測各蛋白的表達情況；應用免疫熒光染色法（immunofluorescence）分別對微管蛋白（Tubulin）、著絲粒相關蛋白（CREST）和DNA染色，熒光顯微鏡下觀察各綠色熒光融合蛋白在有絲分裂末期的亞細胞定位.結果發現，細胞有絲分裂末期，驅動蛋白分子Kif14的N末端GFP融合蛋白定位于中小體（midbody），馬達區GFP融合蛋白沿微管分布，桿狀尾區GFP融合蛋白以點狀分布于細胞質，尾區GFP融合蛋白分布于整個細胞中.由此認為，Kif14驅動蛋白分子的N末端延伸區決定該蛋白分子在細胞有絲分裂末期定位于中小體.

驅動蛋白；Kif14；有絲分裂末期；中小體

驅動蛋白超家族是一類具有ATP水解酶活性、以微管為軌道定向運動的馬達蛋白［1-2］，它們參與調控細胞的基本生命活動過程.驅動蛋白分子Kif14（kinesin family member 14）屬于Kinesin-3亞家族［3］，它對于機體順利完成細胞有絲分裂、維持基因組穩定性以及細胞內物質運輸具有重要作用［4］.在細胞有絲分裂末期，Kif14對于順利形成中小體以及最后的細胞分裂至關重要，應用siRNA干涉Kif14時，細胞不能形成完整中小體，并且無法對細胞進行最后切割，最終會形成多核細胞［5-6］.了解驅動蛋白分子Kif14各功能域在細胞有絲分裂末期的具體作用，將有助于闡明細胞有絲分裂末期的切割機制，但首先要明確Kif14各結構域在細胞有絲分裂末期的定位.

本研究通過構建Kif14不同功能域的綠色熒光蛋白真核細胞表達質粒，轉染真核細胞后觀察各功能域在細胞有絲分裂末期的綠色熒光融合蛋白的定位，探討決定Kif14在細胞有絲分裂末期定位的功能域.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

pEGFPC1真核表達載體、pEGFPC1-Kif14真核表達質粒為本實驗室自存；大腸桿菌感受態細胞TOP10購自北京全式金生物技術有限公司；人子宮頸癌細胞HeLa為本實驗室保存細胞株.

1.1.2 主要試劑

高保真PCR Taq酶（日本東洋紡公司）；限制性內切酶SalⅠ、BamHⅠ以及轉染試劑Turbofect（美國Fermentas公司）；細胞完全培養基DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；鼠抗Tubulin抗體、CREST、FITC或Texas Red標記的羊抗二抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Invitrogen公司）；T4 DNA連接酶和DNA Marker（大連寶生物公司）；凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；其他化學試劑為進口或國產分析純.DNA序列測定和引物合成均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成.

1.1.3 主要儀器

Mycycler普通PCR儀、miniPROTEAN tera system小型蛋白電泳儀（美國Bio-rad公司）；ECLIPSE TS100倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）.

1.2 方法

1.2.1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達質粒的構建

設計Kif14各功能域的上下游引物，如表1所示.以pEGFPC1-Kif14質粒為模板，分別擴增各功能域核酸序列，經過凝膠回收后，用限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后再次回收.回收產物與已被限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后的載體pEGFPC1以適當比例用T4 DNA連接酶室溫連接4 h，將全部連接產物轉化TOP10感受態細胞，篩選陽性克隆，小量提取質粒后進行雙酶切鑒定.將初步鑒定正確的質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測序.

1.2.2 細胞培養與質粒轉染

將人體子宮頸癌細胞HeLa接種于24孔板，每孔接種40 000個細胞，每孔含有體積分數為10%的胎牛血清DMEM培養基500 μL，置于37℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養，待細胞貼壁或爬片后進行質粒轉染.使用Turbofect作為轉染試劑，分別轉染100 ng已構建好的Kif14各功能域質粒，對照組轉染等劑量的pEGFPC1空載體，繼續培養24 h后，在熒光顯微鏡下觀察是否表達綠色熒光蛋白.

表1 Kif14各功能域上下游引物Tab.1 Upstream and downstream primers of each functional domain in Kif14

1.2.3 Western Blot檢測蛋白表達

在24孔板中，各質粒轉染24 h后，刮取細胞，用含有質量分數為2%的SDS buffer（SDS質量分數為2%，甘油體積分數為10%，Tris-Cl濃度為50 mmol/L，pH為6.8，β-巰基乙醇體積分數為1%，溴酚藍質量分數為0.004%）裂解細胞，得到全細胞裂解液.取20 μL上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺質量分數為12.5%，恒定電流為35 mA，分離蛋白質1 h之后轉膜至PVDF膜，用質量濃度為50 mg/mL的脫脂奶粉（TBS浴）封閉30 min后，以兔抗GFP為一抗室溫孵育2 h，以偶聯了辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體為二抗室溫孵育1 h，用增強化學發光劑（ECL）反應2 min，暗室內顯影.

1.2.4 細胞免疫熒光染色

在24孔板中，爬片細胞經轉染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，細胞表達綠色熒光的比率超過60%即可進行免疫熒光染色.取出爬片后用PBS洗3次，每次5 min，采用福爾馬林固定液（含有體積分數為3%的甲醛、質量分數為2%的蔗糖的PBS緩沖液）固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，甘氨酸終止5 min.用體積分數為10%的山羊血清（山羊血清體積分數為10%、TritonX-100質量分數為0.4%的PBS緩沖液）封閉30 min，用質量分數1%的PBS-TX洗3次，每次5 min.加入鼠抗Tubulin抗體和CREST室溫孵育4 h，用質量分數為1%的PBS-TX洗3次，每次5 min.加入Texas Red標記的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗避光孵育2 h后加入DAPI，室溫避光3 min.用質量分數為1% 的PBS-TX洗3次，每次5 min，加入抗淬滅劑后封片.

2 結果

2.1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達質粒的構建

Kif14的結構模式圖和已構建各功能域的模式圖如圖1（a）所示.構建的GFP重組表達質粒pEGFPKif14N356、pEGFP-Kif14Motor、pEGFP-Kif14C940和pEGFP-Kif14C416分別用限制性內切酶 SalⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定.瓊脂糖凝膠電泳分析結果表明，Kif14各功能域目的片段均已成功插入載體中，如圖1（b）所示.測序后，經與NCBI公布序列比對，DNA序列信息完全相同，讀碼框正確，證明已成功構建了各功能域重組質粒.

圖1 Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達質粒的構建Fig.1 Construction of GFP-expressing plasmids of Kif14 domains

2.2 Kif14各功能域綠色熒光蛋白的表達及在細胞有絲分裂末期的細胞內定位

將構建成功的Kif14各功能域綠色熒光蛋白表達質粒分別轉染至HeLa細胞中，獲得全細胞裂解液，進行Western Blot檢測，結果如圖2所示.由圖2可知，各個融合蛋白均有表達，且蛋白相對分子質量與理論值相符.應用免疫熒光對已轉染的各重組質粒細胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察各功能域的細胞內定位，結果如圖3所示.在細胞有絲分裂末期，Kif14的N末端延伸區集中定位于中小體上，馬達區綠色熒光沿微管分布，桿狀尾區綠色熒光以點狀分布于細胞質內，尾區綠色熒光分布于整個細胞中.

圖2 Kif14各功能域綠色熒光融合蛋白的表達Fig.2 Expression of GFP fusion protein of Kif14 domains

3 討論

Kif14基因位于人染色體1q32.1上，該基因編碼1648個氨基酸，蛋白分子質量約為1.865×105（186.5kDa），1994年由Nomura等［7］從骨髓細胞cDNA文庫中首次克隆.Kif14蛋白最先被發現參與調控細胞有絲分裂過程中姐妹染色體的整列［8］，隨后研究發現Kif14在胞質分裂過程中也起重要作用［5-6，9］.應用RNAi敲降Kif14發現，敲降效率達到80%以上時，細胞明顯出現多倍性.缺失Kif14細胞不能有效完成胞質分裂后期事件，破壞細胞周期進程，最終引起胞質分裂失敗，呈現雙核或多核細胞［1］.免疫熒光研究發現，Kif14在間期定位于細胞質中，有絲分裂前中期至中期階段，部分Kif14彌散于細胞質中，部分定位于紡錘體兩極和紡錘體上；進入后期，Kif14集中定位于紡錘體中央區和分裂溝上，隨著有絲分裂進入末期，大量Kif14定位于中小體上［1，5，10］.Citron kinase是一種能與RhoA蛋白分子相互作用的蛋白激酶［11］，在有絲分裂后期定位于分裂溝上，末期定位于中小體上，參與調節胞質分裂［12-14］.免疫熒光實驗發現，Kif14和Citron kinase在有絲分裂后期共定位于分裂溝上，末期共定位于中小體上［10］.Kif14和Citron kinase之間的相互作用使Citron kinase能夠及時從分裂溝轉移到中小體，而Kif14由分裂溝向中小體的聚集和保持也依賴Citron kinase［6］.RNAi無論干涉Kif14還是Citronkinase，細胞都不能對不完整的中小體進行最后切割，最終形成多核細胞.然而，Kif14在最后的中小體切割過程中的具體作用和機制還不明確，因此，研究確定Kif14在有絲分裂末期定位的功能域對闡明最后的中小體切割機制至關重要.

本研究通過構建Kif14不同功能域的真核表達質粒，轉染Hela細胞，發現細胞有絲分裂末期，驅動蛋白分子Kif14的N末端延伸區綠色熒光定位于中小體，馬達區綠色熒光沿微管分布，桿狀尾區綠色熒光以點狀分布于細胞質，尾區綠色熒光分布于整個細胞中.實驗表明：外源蛋白只要含有Kif14的N末端延伸結構域，就可以在有絲分裂末期定位于中小體上；相反，其他功能域蛋白不含有Kif14的N末端延伸結構域，就不能在有絲分裂末期定位于中小體上.因此，本研究認為決定Kif14在有絲分裂末期定位于中小體的功能域是N末端延伸結構域.

臨床研究顯示，Kif14在多種腫瘤中存在基因擴增和高表達現象［2，15-17］，并且與腫瘤的病理分級、預后密切相關，這表明Kif14可作為多種腫瘤發生發展的標志物［18-21］.研究Kif14的分子功能機制將對尋找新的藥物靶點、有效治療惡性腫瘤提供新的思路.

圖3 細胞有絲分裂末期Kif14各功能域的定位Fig.3 Localization of Kif14 domains in telophase cells

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（責任編校 紀翠榮）

Study on intracellular midbody localization of kinesin moter protein Kif14

MA Xin1，JIANG Wei1，2，ZHU Changjun2
（1.Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China；2.College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To study the domain of Kif14 that determines its midbody localization in telophase in eukaryotic cells，the green fluorescent protein（GFP）expression plasmids for different Kif14 domains were constructed and transfected into HeLa cells respectively.The expression of GFP-fused proteins were detected by Western Blot and the localization of these proteins was detected by immunofluorescence staining.The results showed that the GFP-fused N-terminal extension domain of Kif14 locates in midbody in telophase，GFP-fused motor domain distributes along the microtubule，GFP-fused stock and tail domain appears dots distribution in cytoplasm，and GFP-fused tail region distributes throughout the cell.In conclusion，N-terminal extension of Kif14 determines its localization in midbody in telophase.

kinesin；Kif14；telophase；midbody

Q966

A

1671-1114（2016）03-0054-05

2016-01-08

國家自然科學基金面上資助項目（31271485）；2011年教育部“新世紀優秀人才支持計劃”資助項目（NCET-11-1066）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃一般資助項目（14JCYBJC24200）；天津市科技型中小企業技術創新資金資助項目（14ZXCXSY00121）.

馬 新（1990—），女，碩士研究生.

朱長軍（1974—），男，教授，主要從事細胞有絲分裂調控機制以及細胞骨架功能方面的研究.