基于散射信號的超分辨光學相減顯微鏡

周　前　于建強　趙立波　李德勝　吳　魁　朱建華　袁景和,*　方曉紅

(1四川大學物理學系，成都610064；2高能量密度物理及技術教育部重點實驗室，成都610064；3中國科學院化學研究所分子納米結構與納米技術實驗室，北京100190；4北方工業大學理學院，北京100144；5中國科學院化學研究所高分子物理與化學實驗室，北京100190；6中國科學院化學研究所活體分析化學實驗室，北京100190)

基于散射信號的超分辨光學相減顯微鏡

周前1,2,3于建強4趙立波3李德勝5吳魁6朱建華1,2袁景和3,*方曉紅3

(1四川大學物理學系，成都610064；2高能量密度物理及技術教育部重點實驗室，成都610064；3中國科學院化學研究所分子納米結構與納米技術實驗室，北京100190；4北方工業大學理學院，北京100144；5中國科學院化學研究所高分子
物理與化學實驗室，北京100190；6中國科學院化學研究所活體分析化學實驗室，北京100190)

現有的光學超分辨顯微成像技術主要依賴于特殊的熒光標記物，其對于大多數非熒光樣品的超分辨成像就變得無能為力。因此我們提出將光學相減顯微技術應用到非熒光樣品的成像當中，利用普通共聚焦光斑和面包圈型光斑分別激發樣品的散射光成像，從而得到樣品同一區域的兩幅圖像，再通過圖像相減的方法提高了圖像空間分辨率。不同于一般的超分辨成像方法，這種光學相減顯微鏡不需要特殊的樣品預處理過程，同時兩次成像的激發光強度可以保持在一個較低水平，避免了樣品損傷的影響。隨后金納米小球和有機聚合物微絲的散射成像實驗證明了光學相減顯微鏡可以將空間分辨率提高到215 nm(0.33λ，1λ=650 nm)，并且通過探測散射信號得到更多的樣品細節信息。

超分辨顯微鏡；圖像相減；非熒光成像；光散射成像

1　引言

幾個世紀以來，光學顯微鏡的發展極大地提高了人們對細胞結構和細胞功能的認識，但由于光學衍射極限的存在，光學顯微鏡空間分辨率通常在數百納米左右，這使得其在細胞器和分子水平的細胞生物學探測中受到了極大的限制。近來，一些基于熒光探針的超分辨光學顯微鏡打破了光學衍射極限的限制，其中包括隨機光學重構顯微技術(STORM)1、光活化定位顯微技術(PALM)2、受激輻射耗盡顯微技術(STED)3,4等，這些成像技術依賴特殊的熒光分子基團，無法實現非熒光樣品的超分辨成像。于此同時也出現了一些非熒光超分辨成像的方法，例如Wang等5利用樣品分子的電子吸收過飽和效應，在空間上調制了激發光斑點擴展函數，從而提高了非熒光樣品成像分辨率。Ye等6設計了一種平面超薄透鏡組，入射電場在透鏡組相平面處幾乎只有縱向分量，從而減少了光斑橫向面積，提高光學空間分辨率。但這些方法往往利用了特殊的分子能級結構或光學體系，在適用性和實現難度上都有很大限制。而另一方面光學相減顯微技術(optical subtraction microscopy)通過不同條件下兩次成像相減的方法提高成像的空間分辨率，自理論上提出以來7，其主要用于簡單快捷地提高熒光成像的空間分辨率和信噪比8－10上。雖然無法達到之前幾種熒光超分辨技術數十個納米的空間分辨水平，但光學相減顯微鏡對激發光和樣品并無特殊要求，這使得將其應用到非熒光樣品成像成為可能。

我們提出利用光學相減顯微技術，通過兩次光散射成像相減的方法來獲得非熒光樣品的超分辨圖像，通過普通共聚焦光斑激發的散射成像作為被減圖像，再使用面包圈型光斑激發同一區域的散射成像作為減數圖像，兩者相減來獲得超分辨成像。因為無需特殊的熒光分子基團，不必考慮熒光激發和發射光譜對波長的限制，所以兩次散射成像可以使用同一激發波長。另外光學相減顯微成像技術相比于其他超分辨技術擁有幾個優勢：首先，激發光功率可以減低到普通共聚焦顯微鏡的水平，不同于STED顯微技術使用高功率激光激發的情況，減小樣品損傷和潛在的光漂白現象。其次，被減圖像和減數圖像都通過共聚焦掃描的方式獲得，其成像速度遠遠快于STORM和PALM顯微技術。另外，采用樣品分子普遍存在的散射光作為信號源，具有廣泛的適用性。最后，在整個成像過程中只使用同一波長的激發光，并且兩幅圖像的采集相互獨立，不存在時間同步的問題，這簡化了整個系統的結構。實際上這個工作證明了光學相減顯微技術可以被看作一種新型的結構光照明成像方法，同時應用到熒光和非熒光的超分辨成像當中。

2　基本原理和實現方法

2.1光學相減顯微鏡的基本原理

在共聚焦成像中，顯微鏡的點擴展函數PSF (the point-spread function)可以被描述為

其中 p(x,y)是共聚焦系統針孔的尺寸，?是卷積運算符。PSFi(x,y)和PSFj(x,y)分別代表了激發物鏡和收集物鏡的點擴展函數，對于倒置共聚焦顯微鏡，激發物鏡同時用作收集物鏡，因此PSFi(x,y)=PSFj(x,y)=PSFl(x,y)，PSFl(x,y)是倒置共聚焦顯微鏡所使用物鏡的點擴展函數，于是整個系統的點擴展函數又可以被描述為：

則像平面中光場強度分布I(x,y)被描述為

Iscat(x,y)代表了在焦平面的散射信號強度分布，滿足以下關系：Iscat(x,y)=σ(x,y)Ie(x,y)，其中σ(x,y)為散射截面，Ie(x,y)為外界激發光強分布。至此共聚焦光斑激發(confocal excitation)的散射圖像Ic(即相減顯微鏡當中的被減圖像)和面包圈型光斑激發(doughnut excitation)的散射圖像Id(即相減顯微鏡當中的減數圖像)可以通過公式(2)和(3)進行計算。它們各自的點擴展函數 PSF(x,y)分別寫成PSFc(x,y)和PSFd(x,y)，并可以通過矢量衍射理論計算出來11－13。

對于我們的光學相減顯微鏡，兩幅圖像的激發波長都設定為λ=650 nm，并且以圓偏振光進入物鏡后口消除各向異性對成像的影響，物鏡數值口徑(NA)為1.4。對于一個獨立點的散射成像，其Ic和Id的計算結果分別為圖1的(a)和(b)，圖1(c)則表示了兩者相減得到的相減圖像(Is)的橫截面。

在像平面中相減圖像的強度分布Is可以由以下式獲得：

其中r為一個可調參數，如圖1(c)所示，在被減圖像Ic中單點的半高寬(FWHM)約為314 nm，而隨著r值的增加，即減數圖像權重增大時，相減圖像的空間分辨率也隨之提高。當r=1時，Is的橫截面的半高寬為240 nm，當r=2時，其減小至207 nm。理論上空間分辨率可以隨r值增大而無限提高，但實際實驗中受到面包圈型光斑中心光強無法完全為零，加上成像噪聲的影響，當r過大時，會導致被減圖像信號完全被減數圖像淹沒的情況，從而損失大量原有的圖像細節，為了保證相減圖像具有較高的信噪比，實驗中r值通常事先設定為，并在此基礎上適當改變r值，通過計算不同r值條件下的相減圖像信噪比，來確定相減圖像信噪比達到最佳狀態時r值的大小。

圖1　單點的相減成像模擬結果Fig.1　Simulated subtraction imaging of an isolated scattering point(a)Ic:confocal excitation image intensity;(b)Id:doughnut excitation image intensity,λ=650 nm in(a)and(b);(c)normalized line intensity profiles of Ic,Idand subtraction image Is,when r=1 and r=2, r is a controllable parameter based on the signal to noise ratio of subtraction image.

圖2　超分辨光學相減顯微鏡的示意圖Fig.2　Schematic diagram of the super resolution subtraction microscopeSC:super continuum laser;SPF:short pass filter;BPF:bandpass filter; PBS:polarizing beam splitter;S1,S2:shutters;BE1,BE2:beam expanders;SMF:single mode fibers;VPP:vortex phase plate; BS1,BS2:beam splitter;QW:quarter wave plate; PMT:photomultiplier tube detector

2.2實驗裝置

我們所使用的光學相減顯微鏡的基本結構是基于之前被報道過的自制STED顯微鏡14的基礎上設計完成的(如圖2所示)。整個系統使用了普通倒置光學顯微鏡(IX71,Olympus,Japan)作為基本平臺，利用超連續皮秒脈沖激光器(Fianium,Southampton,UK)作為光源，其波長范圍從可見光波段到近紅外波段(450－1750 nm)，脈沖寬度為350 ps，重復頻率為1 MHz。在激光器出口處設置一塊窄帶濾波片(BPF,FF01-650/13-25,Semrock,New York,USA)用以選擇出650 nm作為激發波長。之后經過偏振光分離晶體(CVI,Albuquerque,USA)將光路分為偏振狀態相互垂直的兩路線偏振光，分別作為被減成像和減數成像的激發光源。兩路光又分別經過兩組擴束透鏡組(BE1,BE2)之后耦合到單模保偏光纖(SMF,THORLABS,New Jersey,USA)中以保證光束質量并簡化整個成像系統。其中減數成像的激發光路又經由螺旋位相板(VPP,RPC Photonics,Rochester,NY,USA)以獲得0－2π的螺旋位相調制，在物鏡焦平面處形成面包圈型光斑，螺旋位相板厚度對應激發波長650 nm，以保證面包圈型光斑質量。單模光纖輸出的兩路光先通過一塊平面分束鏡(BS1,THORLABS,New Jersey, USA)耦合共線，再利用一塊半反半透分束鏡(BS2, THORLABS,New Jersey,USA)引入油介質物鏡(UPlan Sapo,NA=1.4,100×,Olympus,Japan)后口以及實現激發光和散射信號光的分離。另外，一塊四分之一波片(THORLABS,New Jersey,USA)被放置在分束鏡BS1和BS2之間，以保證兩路激發光都為圓偏振光。樣品的散射信號通過同一物鏡收集之后，經過一個共聚焦針孔后由光電倍增管探測器(PMT,THORLABS,New Jersey,USA)探測。整個系統的圖像掃描通過安裝在顯微鏡平臺上的壓電位移臺(P-545.3C7,PI,Germany)單線掃描移動來實現。PMT探測器和位移臺都連接在一塊數據采集卡(PCIe-6353,NI,USA)當中，以實現信號采集以及探測器與位移臺同步等控制，而被減成像和減數成像的切換則通過兩個快門(S1和S2, LS3T2,Uniblitz,USA)的開關來控制。

被減成像和減數成像的激發功率一般為10μW左右(物鏡后口測得)，重復頻率為1 MHz，并且由于兩者成像過程相對獨立，所以不存在時間同步和對準。最后得到的所有實驗數據的分析和演示都通過我們自己編寫的Matlab程序進行。

2.3樣品的制備

金納米小球樣品：采用購買的金溶膠溶液(Φ 80 nm gold bead,Accurate Chemical&Scientific Corporation,New York,USA)和10－3mol?L－1的聚乙烯醇溶液(PVA，Sigma-Aldrich Corporation,USA) 以1:10的體積比混合后，超聲30 min得到的混合溶液，隨后旋涂(4000 r?min－1,30 s)至洗凈的玻璃片上并晾干。

有機聚合物微絲：10%(w)聚異丁烯酸異丁酯的二甲基甲酰胺(DMF)溶液作為聚合物，通過電紡絲的方法在玻璃片表面制備有機聚合物微絲。聚合物針尖與玻璃片之間的電壓為1.5 kV?cm－1。有機溶劑流速為100μL?h－1。

3　實驗結果和討論

3.1金納米顆粒的相減成像

我們首先利用80 nm金納米顆粒成像來驗證相減顯微成像方法提高空間分辨率的能力。圖3表示了樣品同一區域(10μm×9μm)的普通共聚焦激發散射成像Ic(被減圖像)和相減顯微成像Is結果。實驗中單個掃描步長為50 nm，采集時間為1 ms，被減圖像和減數圖像的激發光在物鏡后口所測得的功率都為12μW，脈沖重復頻率為1 MHz，可調參數r=1.2。如圖3(a)中所示的兩個相鄰金納米顆粒(白色箭頭所指處)，其無法通過普通共聚焦成像清楚地區分開來，而在經過Ic和Id相減處理之后得到Is，兩個金納米顆粒分別在Ic和Is的橫截面圖如圖3 (d)所示，可見兩個顆粒被清楚的區分開來。圖3(e)顯示了單個金納米顆粒分別在共聚焦圖像和相減圖像當中的橫截面(圖3(a)和圖3(c)藍色箭頭所指處)，可測得共聚焦成像(圖3(a))中金納米顆粒的半高寬在319 nm，但在相減成像(圖3(c))結果中金納米顆粒半高寬減小到了215 nm，約為0.33λ，相比于共聚焦成像的結果，空間分辨率有了明顯的提高。

3.2有機聚合物微絲的相減成像

我們使用有機聚合物微絲作為成像樣品進一步驗證相減顯微鏡的空間分辨能力(圖4)。為了確定聚合物微絲的真實尺度，我們采用掃描電子顯微鏡(SEM)對聚合物微絲進行了成像，如圖4(a)所示，聚合物體系由細小的微絲和尺寸較大的紡錘體組成，微絲的寬度通常在180－500 nm之間，而紡錘體寬度通常在數個微米。針對聚合物微絲進行光學相減成像，兩幅圖像的掃面范圍為30μm× 30μm，單個步長為60 nm，采集時間為1 ms，激發光功率都為12μW，重復頻率為1 MHz，調節參數r=0.85。對比掃描電子顯微鏡的結果，我們發現對于紡錘體而言只有紡錘體邊緣的散射信號能被光學顯微鏡探測到，這是由于在介質邊界處具有更強烈的散射信號所致。通過對比共聚焦圖像(圖4(b))和相減圖像(圖4(c))的結果可知，空間分辨率有了較大的提高，一些共聚焦成像中無法顯示的圖像細節在相減成像得到了展現。例如兩幅圖中白色箭頭所指的一個小紡錘體位置，紡錘體邊緣在共聚焦成像中重合到了一起，而在相減成像中兩者被清楚地區分了開來(圖4(d))。在藍色箭頭所示單個微絲的位置，在相減成像中微絲兩個邊緣也被探測成像出來，而共聚焦成像中只是單線的形狀(圖4(e))。因此可以證明在復雜樣品的成像中，相減顯微成像技術也能顯著提高圖像的空間分辨率。

圖3　通過相減顯微技術得到的金納米顆粒的超分辨成像Fig.3　Super-resolution imaging of the gold nanobeads by the subtraction microscopy(a)confocal excitation image;(b)doughnut excitation image;(c)super-resolution subtraction image; (d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arrows in(a)and(c); (e)normalized intensity profiles along lines indicated by blue arrows in(a)and(c).The bar scale is 1 μm in(a),(b),and(c).

圖4　有機聚合物微絲的相減顯微成像Fig.4　Super-resolution imaging of the polymer nanofibers with the subtraction microscopy(a)scanning electron microscope(SEM)image of polymer nanofibers,the bar scale is 1 μm in inset;(b)confocal image; (c)super-resolution subtraction image,the bar scale is 3 μm in(b)and(c);(d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arrows in (b)and(c);(e)normalized intensity profiles along lines indicated by bule arrows in(b)and(c).

上述實驗結果證明了光學相減顯微技術能夠利用散射光作為信號源實現非熒光樣品的超分辨成像。不同于之前的超分辨成像技術需要利用熒光分子基團，光學相減顯微技術的兩路激發光原則上可以使用任意波長，無需高激發功率和復雜樣品制備過程，減小了樣品的光損傷。

4　結論

提出了利用光學相減顯微鏡獲得非熒光樣品超分辨成像，通過共聚焦散射成像作為被減圖像，面包圈形光斑激發的散射成像為減數圖像，兩圖像相減的方法提高圖像的空間分辨率，兩者的激發波長可以為任意的單一波長，并且激發功率可以在較低水平。使用相減顯微成像技術對金納米顆粒以及有機聚合物微絲進行成像實驗，結果證明金納米顆粒半高寬從316 nm下降至215 nm，約為0.33λ；而聚合物微絲樣品圖像的空間分辨率也有明顯的提高。由于實驗采用散射光作為信號源，證明了光學相減顯微鏡適用于任何光學信號來源，其在生物醫學以及其他領域的應用前景也得到了擴展。

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最后借用何顯斌教授的一句話:“只有當刑罰以正義和人道為基本價值取向的時候，刑法的價值—秩序和自由才能實現并確保和諧的共生關系。”［8］我們設立刑法是為了很好的維護正常的自由、秩序，而不是濫用刑罰。

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Super-Resolution Optical Subtraction Microscopy Using Optical Scattering Imaging

ZHOU Qian1,2,3YU Jian-Qiang4ZHAO Li-Bo3LI De-Sheng5WU Kui6
ZHU Jian-Hua1,2YUAN Jing-He3,*FANG Xiao-Hong3
(1Department of Physics,Sichuan University,Chengdu 610064,P.R.China;2Key Laboratory of High Energy Density Physics and Technology of Ministry of Education,Chengdu 610064,P.R.China;3Key Laboratory of Molecular Nanostructure and Nanotechnology,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;4College of Science, North China University of Technology,Beijing 100144,P.R.China;5State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;6Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

The existing form of super-resolution microscopy based on specific fluorescent tagging is unable to obtain super-resolution images of non-fluorescent samples.Hence,we have developed optical subtraction microscopy for obtaining super-resolution imaging in such cases.This method is based on image subtraction between the two optical scattering images from general confocal excitation and doughnut-shaped excitation, respectively.Unlike super-resolution fluorescence microscopy,subtraction microscopy requires no preprocessing of the sample,and the excitation power can be kept low to avoid sample damage.The non-fluorescent imaging of gold nanobeads and polymer nanofibers has been realized to demonstrate the feasibility of super-resolution subtraction microscopy.The lateral resolution decreases to 215 nm(0.33λ,1λ=650 nm)in subtraction imaging,and greater imaging detail of the sample is achieved via optical scattering.

Super-resolution microscopy;Subtraction imaging;Non-fluorescence imaging; Optical scattering imaging

February 25,2016;Revised:March 22,2016;Published on Web:March 23,2016.

O644

［Article］10.3866/PKU.WHXB201603234www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding author.Email:jhyuan@iccas.ac.cn;Tel:+86-10-62561679.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2013CB933701),National Natural Science Foundation of China(21127901,91413119)and Key Technology Talent Program of ChineseAcademy of Sciences.

國家重點基礎研究發展規劃項目(973)(2013CB933701),國家自然科學基金(21127901,91413119)和中國科學院“關鍵技術人才”項目資助