MRP8/MRP14對宮頸癌細胞增殖的影響及機制

胡兵榮，王娟，羅海華，姜勇

(南方醫科大學基礎醫學院，廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣州510515)

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MRP8/MRP14對宮頸癌細胞增殖的影響及機制

胡兵榮，王娟，羅海華，姜勇

(南方醫科大學基礎醫學院，廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣州510515)

目的探討髓樣相關蛋白8/14異源二聚體(MRP8/MRP14)對宮頸癌細胞增殖的影響及機制。方法體外培養人宮頸癌Hela細胞，加入MRP8/MRP14(觀察組)，另設對照組加入等體積PBS，于培養12、24、48、72 h分別采用CCK8法檢測兩組細胞增殖能力。取Hela細胞進行核質分離，加入MRP8/MRP14共培養30 min，采用Western blot法檢測細胞凋亡相關信號通路蛋白p38 MAPK、JNK及細胞增殖相關信號通路蛋白ERK1/2、NF-κB表達。將Hela細胞分為MRP8/MRP14組和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑組，RP8/MRP14組加入MRP8/MRP14；抑制劑組先分別加入p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑預處理2 h，再加入MRP8/MRP14；采用CCK8法觀察各組細胞增殖能力。結果觀察組加入MRP8/MRP14培養12、24、48、72 h后，細胞增殖能力均高于對照組，且隨時間延長，細胞增殖能力逐漸增強(P均<0.05)。觀察組加入MRP8/MRP14培養30 min后，與對照組比較，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明顯升高，NF-κB在細胞核中的表達升高(P均<0.05)。p38 MAPK、JNK抑制劑組細胞增殖能力較MRP8/MRP14組增強；ERK、NF-κB抑制劑組細胞增殖能力較MRP8/MRP14組減弱(P均<0.05)。結論 MRP8/MRP14能夠促進Hela細胞增殖，其機制與p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多條相關信號通路被激活有關。

宮頸癌；髓樣相關蛋白8/14異源二聚體；細胞增殖

髓樣相關蛋白8(MRP8)和髓樣相關蛋白14(MRP14)均屬于鈣結合蛋白S100家族成員，是重要的內源性損傷相關模式分子[1]，在體內主要以異源二聚體MRP8/MRP14的形式發揮其生物學活性。MRP8/MRP14的生物學功能極其豐富，參與蛋白質磷酸化、細胞骨架重塑、細胞遷移、調節鈣離子穩態、花生四烯酸代謝、對中性粒細胞中的NADPH氧化酶的調控等過程[2]。研究表明，MRP8/MRP14與腫瘤的發生發展、轉移有密切關系[3]。p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB在多種腫瘤中廣泛表達并參與介導細胞的分化、增殖及凋亡[4～6]。目前,關于MRP8/MRP14在宮頸癌中的作用少見報道。2015年2～12月，我們觀察了MRP8/MRP14對宮頸癌Hela細胞增殖的影響，并觀察細胞凋亡通路相關蛋白p38 MAPK、JNK及細胞增殖通路相關蛋白ERK1/2、NF-κB的表達情況，探討MRP8/MRP14在宮頸癌發生發展中的作用及機制。

1　材料與方法

1.1材料子宮頸癌Hela細胞株由本實驗室凍存。MRP8與MRP14蛋白分別使用大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞從構建完成的原核表達載體中純化得到，參照文獻[4]方法按等摩爾比混勻，使其形成MRP8/MRP14。核質分離勻漿緩沖液和核質分離核提取緩沖液參照文獻[5]方法配置。

1.2細胞培養將Hela細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置5% CO2、37 ℃培養箱中，待細胞生長至85%融合時進行傳代。

1.3MRP8/MRP14對細胞增殖能力影響觀察取對數生長期細胞，以3×103/孔接種于96孔板，觀察組加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另設對照組加入等體積PBS。培養12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8，繼續孵育2 h。使用酶標儀于450 nm處檢測各孔吸光度A值，以此表示細胞增殖能力。

1.4MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達影響觀察采用Western blot法。取對數生長期細胞，以3×105/皿接種于培養皿，觀察組加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另設對照組加入等體積PBS。培養30 min后加入相應一抗4 ℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的HRP標記的抗鼠IgG室溫孵育1 h。經化學發光底物顯色，利用Kodak IS4000R圖像工作站檢測p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性。另取對數生長期細胞進行核質分離，按上述方法檢測細胞核中NF-κB表達，以Lamin B1單克隆抗體作為內參，以目的蛋白與內參的灰度比值表示目的蛋白的活性或表達量。

1.5p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14作用影響觀察取對數生長期細胞，以3×103/孔接種于96孔板，分為MRP8/MRP14組和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑組，每組設5個復孔。MRP8/MRP14組加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14；抑制劑組先分別加入SB203580、SP600125、PD98095、Bay117082預處理2 h，再加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14。培養12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8孵育2 h，使用酶標儀于450 nm處檢測各孔吸光度A值,以此表示細胞增殖能力。

2　結果

2.1MRP8/MRP14對細胞增殖能力的影響培養24 h后，觀察組較對照組細胞增殖明顯增強(P均<0.05)，隨作用時間延長，細胞增殖更加明顯(P均<0.01)。

表1　MRP8/MRP14對細胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達的影響加入MRP8/MRP14后，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及細胞核內NF-κB 表達均明顯增加。見表2。

表2　MRP8/MRP14對p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14的細胞增殖作用的影響與MRP8/MRP14組比較，p38 MAPK、JNK抑制劑組細胞增殖能力隨時間延長逐漸增強，ERK1/2、NF-κB抑制劑組細胞增殖能力隨時間延長逐漸下降(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3　p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對MRP8/MRP14細胞增殖作用的影響

注：與MRP8/MRP14組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3　討論

MRP8/MRP14屬鈣結合蛋白S100家族成員，目前其研究主要集中在炎癥及自身免疫性疾病發展過程中的作用。S100蛋白家族與腫瘤也有密切關系，廣泛參與胃癌、前列腺癌、皮膚癌、食管癌、結直腸癌等多種腫瘤的發展、轉移及免疫耐受過程[7]。探討MRP8/MRP14在宮頸癌發生發展中的作用及機制具有重要意義。

本研究顯示，MRP8/MRP14可顯著促進宮頸癌細胞增殖。進一步觀察顯示，MRP8/MRP14可促進腫瘤增殖、凋亡相關信號通路中的重要激酶p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明顯升高，細胞核中的NF-κB表達也顯著增多，表明它們相對應的信號通路被激活。使用ERK1/2及NF-κB磷酸化激酶抑制劑后，Hela細胞增殖能力明顯減弱；使用p38 MAPK、JNK磷酸化激酶抑制劑后，由于促凋亡通路被抑制，MRP8/MRP14的促細胞增殖能力反而稍有增強。

早期研究發現，多種致炎因子可以激活Hela細胞中的p38 MAPK信號通路，促進抑癌基因c-myc翻譯增加，從而啟動Hela細胞凋亡程序[8]；JNK通路活化使c-Jun磷酸化水平增加并增強Caspase-3活性，在細胞凋亡中發揮重要作用[9]；ERK1/2通過調節可易位基因c-myc的表達，促進腫瘤細胞增殖和轉移[10]；腫瘤發生發展過程中NF-κB激酶活性增加與腫瘤生長轉移密切相關[11]。因此，細胞增殖多數是由于促進細胞增殖的通路如ERK1/2和NF-κB被活化或促進細胞凋亡的通路如p38 MAPK、JNK被抑制所產生的表觀效應。本研究顯示，在宮頸癌Hela細胞中，以上多種作用明確的信號通路均在MRP8/MRP14作用后活化。已有報道顯示，MRP8/MRP14在前列腺癌增殖凋亡過程中能同時激活p38 MAPK通路和NF-κB通路，從而發揮細胞因子樣雙向作用[4]。提示MRP8/MRP14對宮頸癌細胞的增殖效應的表現可能不僅僅是由于細胞增殖相關通路的活化或者細胞凋亡通路被抑制，這個過程與p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多條增殖凋亡信號通路均密切相關。宮頸癌細胞受到MRP8/MRP14刺激后，細胞內促進增殖的信號通路與促進凋亡的信號通路同時被激活，而最終MRP8/MRP14對宮頸癌細胞作用的總效應表現為促增殖作用。這可能是由于促增殖效應通路活化更強，而促細胞凋亡效應通路的作用相對較弱，于是細胞產生的促增殖效應更明顯，從而掩蓋了MRP8/MRP14導致細胞產生的促凋亡效應。因此推測，MRP8/MRP14可能是快速進展型宮頸癌的生物學指標之一，如果宮頸癌局部組織中浸潤有MRP8/MRP14，很可能會導致腫瘤細胞增殖加快。通過抑制相應促增殖信號通路(如ERK1/2和NF-κB)或活化相應促凋亡信號通路(如p38 MAPK和JNK)可能有助于控制腫瘤的進展。

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Effects of MRP8/MRP14 on proliferation of cervical cancer cells and the mechanism

HUBingrong,WANGJuan,LUOHaihua,JIANGYong

(SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo investigate the effect of myeloid-related protein-8/14 heterodimer (MRP8/MRP14) on the proliferation of cervical cancer Hela cells and the possible mechanism. MethodsCervical cancer cell line Hela was cultured in vitro and treated with MRP8/MRP14 (observation group) or PBS(control group), then we measured the proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h with CCK8. The nuclear of Hela cells was separated and then Hela cells were cultured with MRP8/MRP14 for 30 min. The expression of apoptosis-related signaling pathway protein p38 MAPK, JNK and proliferation-related signaling pathway protein ERK1/2 and NF-κB was measured by Western blotting. Hela cells were divided into MRP8/MRP14 group, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 and NF-κB inhibitor group. Hela cells in the MRP8/MRP14 group were only treated with MRP8/MRP14, and the inhibitor groups were pretreated with p38 MAPK, JNK, ERK1/2 or NF-κB inhibitor for 2 h then were incubated with MRP8/MRP14. The proliferation ability of Hela cells were detected by CCK8. ResultsCompared with the control group, MRP8/MRP14 enhanced the Hela cell proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h, and the proliferation ability increased gradually as time passed in the observation group (allP<0.05). After the treatment of MRP8/MRP14 for 30 min, p38 MAPK, JNK and ERK1/2 were activated and the expression of NF-κB in the nucleus was increased (allP<0.05). In the p38 MAPK and JNK inhibitor groups, the proliferation ability of Hela cells were increased, while the proliferation ability of Hela cells were decreased in the ERK and NF-κB inhibitor groups as compared with that of the MRP8/MRP14 group (allP<0.05). ConclusionMRP8/MRP14 can promote the proliferation of Hela cells and this mechanism may be related with the activation of p38, JNK, ERK1/2 and NF-κB signaling pathways.

cervical carcinoma; myeloid-related protein-8/14 heterodimer; cell proliferation

國家自然科學基金資助項目(81030055，81372030)。

胡兵榮(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為炎癥與腫瘤細胞信號轉導。E-mail： 1053556694@qq.com

簡介：姜勇(1964-)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為炎癥及細胞信號傳導。E-mail: jiang48231@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.008

R737.33

A

1002-266X(2016)22-0024-03

2016-01-22)