一種提取血小板蛋白的新方法

李　寧, 管　宇, 錢春美, 李永新, 楊興才, 張曉峰

(上海中醫藥大學 附屬上海市中醫醫院, 上海　200071)

?

一種提取血小板蛋白的新方法

李寧, 管宇, 錢春美, 李永新, 楊興才, 張曉峰

(上海中醫藥大學 附屬上海市中醫醫院, 上海200071)

目的:探討高質量提取血小板蛋白的方法。方法:比較傳統與改進后的提取血小板蛋白量,并進行蛋白定量和免疫蛋白印跡實驗。結果:改進后的方法提取蛋白量平均為1.86 g/L,傳統方法為1.21 g/L。免疫蛋白印跡實驗表明,改進后的方法提取蛋白量高于傳統方法,并且APP檢測的結果好于傳統方法。結論:通過實驗可以得出改進后的提取蛋白方法，更有利于進行后續Alzheimer病的機理研究。

蛋白提取; 血小板; β-淀粉樣前體蛋白

在細胞中,蛋白行使著重要的功能,參與細胞所有的功能性過程[1]。近年來,隨著對Alzheimer病(AD)的研究,作為衡量其診斷效果的指標之一的血小板β-淀粉樣前體蛋白(APP)成為研究熱點[2]。血小板表達3種APP異構體:APP695、APP751、APP770。AD患者血小板APP異構體比率(APP130/APP106)異常可作為輔助診斷AD的重要生物指標[3]。從血小板中提取總蛋白檢測APP就成為一個關鍵實驗技術。本研究主要從基礎研究出發,探討一種新型的提取血小板總蛋白的方法,從而簡化其流程。這種新的提取蛋白的方法對進一步研究APP異構率有著重要的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;RIPA蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購自南京凱基生物科技發展有限公司;M22C11抗體購自 Millipore;羊抗鼠二抗購自南京凱基生物科技發展有限公司;檸檬酸購自國藥集團化學試劑有限公司;檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖購自國藥集團化學試劑有限公司;氨基丁三醇購自國藥集團化學試劑有限公司;蛋白酶抑制劑購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;亮抑蛋白酶肽購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;PMSF購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2主要儀器

放射自顯影分析系統為美國Bio-rad公司產品;光譜掃描多功能讀數儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3實驗材料

正常人血,年齡50～80歲。

1.4實驗方法:

本實驗分為兩組對照的提取血小板蛋白方法,一組按照傳統的步驟提取,另一組為改進后的提取方法。

1.4.1傳統提取血小板蛋白

靜脈采血5 mL,2% EDTA-Na2抗凝,離心200g、10 min；取血漿,1 500g、離心15 min后棄去上清,得到血小板,超聲破碎20 s、2次。用BCA蛋白定量試劑盒測其濃度,并進行免疫蛋白印跡檢測。

1.4.2改進后提取血小板蛋白

(1) Buffer A與Buffer B的配制:Buffer A(pH 6.4):38 mmol/L ditric acid (檸檬酸)；75 mmol/L trisodium citrate(檸檬酸三鈉)；136 mmol/L glucose(葡萄糖)。

Buffer B(pH 7.4):5 mmol/L tromethamine(氨基丁三醇)；1 mmol/L egtazic acid(依他酸)；10 mmol/L EDTA；10 mg/L aprotinin (蛋白酶抑制劑)；10 mg/L leupeptin(亮胰蛋白酶肽)0.1 mmol/L PMSF。

(2) 實驗流程:靜脈采血5 mL,2%EDTA- Na2抗凝；9∶1混合Buffer A中,室溫下200g離心10 min；取富含血小板的血漿,1 500 g離心15 min,棄去上清；將沉淀重懸于500 μL的bufferB中,1 500 g離心5 min;然后利用RIPA蛋白提取試劑盒提取蛋白,應用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,并進行免疫蛋白印跡檢測。

2　結果

2.1BCA定量結果

各組分別選取6個采血樣本進行BCA定量分析,結果見圖1。改進方法后,平均5 mL血量提取蛋白為1.86 g/L,而傳統方法提取蛋白量為1.21 g/L。

圖1　兩種方法提取蛋白量的比較(1為改進后提取蛋白量；2為傳統方法提取蛋白量；★ T檢驗P<0.05)

2.2免疫蛋白印跡實驗結果分析

蛋白提取后,進行免疫蛋白印跡分析。上樣量體積為20 μL不變、蛋白濃度不同。結果(見圖2)顯示,改進方法后提取的蛋白量內參GAPDH的表達明顯高于傳統的提取方法。

圖2　兩種方法免疫蛋白印跡檢測比較(1為改進后提取技術,2傳統提取技術)

通過比較AD病人與正常對照組之間APP表達的差異(見圖3),可以看出通過改進方法后提取的蛋白APP的異構率有明顯的差異,可以確定改進方法提取的蛋白可以應用到后續AD發病機理的研究。

圖3　應用新的方法比較AD病人與正常人之間APP的表達(1為AD病人血液,2為正常人血液)

3　討論

APP異構體證實存在于腦脊液、血液和尿液中[4]。血小板膜APP的構成與中樞神經系統相似,區別僅在于mRNA水平和蛋白質水平。有研究表明,研究外周血血小板APP成分能夠為研究AD發病機制和治療提供線索[5-6]。Zubenko等[7]報道AD患者血小板膜可塑性和細胞骨架異常。另有研究表明AD患者血小板APP代謝及不同分子量成分出現異常。文獻[8]表明,AD組的APP130/APP106比率明顯于對照組。AD患者血小板APP加工異常導致APP130/APP106

比率降低,對于鑒別AD患者具有一定的臨床意義。

在同樣的采血量的情況下,改進后的方法明顯提取到多量的蛋白。在進行免疫蛋白印跡實驗中,上樣的體積是一定的,蛋白含量不同(見圖1),并且省略了許多的步驟,節省了時間以及試劑的消耗。本實驗中,作為改進后的提取蛋白方法,借鑒了以往的分離血小板的方法并配制了相應的溶液[9],但是又相對改進了最后一步的提取方法,采用RIPA裂解液裂解血小板的方法提取蛋白,取得了濃度比較高的蛋白樣品,并進一步確定了其相應的目的蛋白的表達[3,9]。在以往的提取血小板蛋白的方法中,用得最多的是高速離心分離血液[10],該方法不僅費時費力,而且容易混雜其他蛋白,造成蛋白純度降低。改進后的方法只需要低速離心就可以取得很好的效果,并且實驗費用降低。此外,改進后的方法中添加了兩種蛋白酶抑制劑,使得提取的蛋白保存時間長,并且在蛋白不變性的情況下保存半年以上,可以進行后續的蛋白檢測實驗。有研究表明,離心力的不同可以導致不同的離心效果[11]。在本實驗中,采用了1 500g的離心力,也取得了理想的效果。在一些特定蛋白提取過程中[12],也可應用一些蛋白特有標志抗體進行提取,但是該方法增加了提取費用,并且后續的功能性檢測更加復雜。

References)

[1] Cooper G M. The cell: a molecular approach[M]. 2nd ed. ASM press, 2000.

[2] Li Q X, White S, Tanner J E, et al. Secretion of Alzheimer’s disease Aβamyloid peptide by activated human platelets[J]. Lab Investigation,1998,78(4):461-469.

[3] Rosenberg R N, Baskin F, Fosmire J A, et al. Altered amyloid protein processing in platelets of patients with Alzheimer disease[J]. Arch Neurol, 1997,54(2):139-144.

[4] Padovani A, Borroni B, Colciaghi F, et al. Platelet amyloid precursor protein forms in AD: a peripheral diagnostic toll and a pharmacological target[J]. Mechanisms Aging Development, 2001,122:1997-2004.

[5] Bush A I, Martins R N, Rumble B, et al. The amyloid precursor protein of Alzheimer’s disease is released by human platelets[J]. J Biol Chem，1990,265:15977-15983.

[6] Diluca M, Colciaghi F, Pastorino L, et al. Platelets as a peripheral district where to study pahtogenetic mechanisms of Alzheimer disease: the ease of amyloidprecursor protein[J]. Eur J pharmacol, 2000,405:277-283.

[7] Zubenko G S, Kopp U, Seto T, et al. Platelet membrane fluidity individuals at risk for Alzheimer disease: a comparison of results from fluorescene spectroscopy and electron spinresponse spectroscopy[J]. Psychopharmacology, 1999,145:175-180.

[8] Borroni B, Volpi R, Martini G, et al.Peripheral blood abnormalities in Alzheimer Disease: evidence for early endothelialdysfunction[J]. Alzheimer Dis Ass Disordecs, 2002,16:150-155.

[9] Borroni B, Colciaghi F, Lenzi G L, et al. High cholesterol affects platelet APP processing in controls and in AD patients[J]. Neurobiol Aging, 2003,24:631-636.

[10] 薛壽儒,楊小旺。血小板β-淀粉樣肽前體蛋白免疫強度及異構體比率對Alzheimer病的診斷價值[J].臨床神經病學雜志, 2007,27(3):176-178.

[11] Pacifici L, Casella F, Maggiore C. Platelet rich plasma(PRP): potentialities and techniques of extraction[J]. Minerva Stomatol, 2002, 51:341-350.

[12] Akopyan K, Lindqvist A, Mullers E. Cell cycle dynamics of proteins and post-translational modifications using quantitative immunofluorescence[J]. Methods Mol Biol, 2016,1342:173-183.

A novel method of extracting platelet protein

Li Ning, Guan Yu, Qian Chunmei, Li Yongxin, Yang Xingcai, Zhang Xiaofeng

(Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071, China)

Objective: To investigate a novel method of extracting high quality protein of platelet. Methods: comparing the novel method and traditional method of extracting protein by BCA quantification and Western blot. Results: The novel method of extracting protein is 1.86 g/L while the traditional method is 1.21 g/L. Western blot also shows that the result obtained from the novel method band is higher than that from the traditional method. The novel method gets a better result through the APP detection. Conclusion: The novel method can be more beneficial to the further research of the mechanism of Alzheimer’s disease.

protein extract; platelets; APP

10.16791/j.cnki.sjg.2016.03.015

2015- 09- 24修改日期:2015- 11- 03

上海市衛生局轉化醫學重點課題“基于APP的調心方治療輕度老年癡呆的臨床轉化研究”(20114029)

李寧(1980—),男,河北安國,碩士,工程師,研究方向為發育生物學.

E-mail: andyleening@163.com

R331.1

B

1002-4956(2016)3- 0056- 02