氟暴露小鼠睪丸形態計量學研究

林坤群,賀鑫晉,劉辰光,盧洪江,李寶鈞,孫子龍

(山西農業大學動物科技學院,山西太谷030801)

氟暴露小鼠睪丸形態計量學研究

林坤群,賀鑫晉,劉辰光,盧洪江,李寶鈞,孫子龍

(山西農業大學動物科技學院,山西太谷030801)

為了觀察小鼠氟中毒睪丸形態變化特點,研究氟對睪丸的毒性影響,選用45只健康性成熟雄性昆明系小鼠,隨機分為對照組、低氟組(25 mg/L NaF)、高氟組(100 mg/L NaF),連續飼喂60 d,制作睪丸石蠟組織切片,H.E.染色后,顯微鏡下觀察曲細精管形態變化,通過定量分析方法探討氟對睪丸的毒性影響.結果表明,與對照組相比,低氟組和高氟組曲細精管半徑、面積以及曲細精管管腔半徑、面積均無顯著性差異(P>0.05);高氟組小鼠曲細精管細胞層數和厚度極明顯低于對照組(P<0.01);形態學觀察顯示,25 mg/L氟中毒小鼠睪丸生精細胞減少,100 mg/L NaF可導致生精細胞排列紊亂、各級生精細胞減少等.本試驗可為氟的雄性生殖毒性研究提供直觀、科學的參考.

氟中毒;睪丸;曲細精管;形態計量學

氟作為一種非常活潑的鹵族元素,以多種化合物形式存在于自然界中.由于其安全范圍極窄,稍有過量就會造成毒性作用,氟中毒已成為全世界廣泛存在的一種人畜共患性地方病,主要對動物的牙齒、骨骼造成損傷,引起氟斑牙、氟骨癥等癥狀[1].除此之外,關于氟對非骨相系統(如生殖、神經、腎、肝、免疫等)影響的研究和報道越來越多[2].自1994年Freni[3]在一項生態學研究中提出,在一些地區總生育力和氟含量呈負相關性以來,越來越多的研究表明氟可引起生殖系統的損傷[4].本研究旨在通過對飲水染氟性成熟雄性小鼠的睪丸組織的結構進行觀察并測量其曲細精管半徑、管腔半徑、曲細精管面積等形態計量學指標,為氟的生殖毒性研究提供理論依據與參考.

1　材料與方法

1.1試驗材料45只昆明系雄性小鼠和飼料由山西醫科大學實驗動物中心提供,氟化鈉(NaF)、Bouin's固定液、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅等由院實驗中心配制.

1.2方法

1.2.1動物模型的建立小鼠購回后進行一周的適應性飼養,隨機分成3個組,進行分籠飼養,依次為對照組,低氟組,高氟組,每組15只.進行如下處理:對照組,飲用蒸餾水;低氟組飲用氟化鈉濃度為25 mg/L的蒸餾水;高氟組飲用氟化鈉濃度為100 mg/L的蒸餾水.自由采食、飲水.

1.2.2樣本采集及切片制作飼喂60 d后脫頸椎處死,迅速取其左側睪丸組織,生理鹽水沖洗,置于Bouin's固定液中固定24 h,自來水沖洗12 h,梯度酒精逐步脫水,置二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、展片、烘片.染色前,脫蠟、染色、透明,中性樹膠封片,于光鏡下觀察睪丸組織形態.

1.2.3統計分析每組切片取30個曲細精管,用Image-Pro Plus5.0進行測量,使用GraphPad Prism 5.0軟件進行One-way ANOVA顯著性檢驗.P< 0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著.

2　結果與分析

2.1睪丸形態計量學指標小鼠曲細精管細胞層的層數、厚度的分析結果見圖1.隨著氟化鈉劑量的增加,曲細精管細胞層的層數和厚度逐漸減少,且高氟組極顯著低于對照組(P<0.01).小鼠曲細精管半徑、面積,管腔半徑、面積的分析結果見圖2、3.與對照組相比,氟組小鼠睪丸曲細精管半徑、曲細精管面積,管腔半徑、管腔面積沒有顯著變化.

2.2睪丸形態結構的變化對照組的曲細精管細胞排列有序,各級生精細胞分布均勻(見中插彩版圖4A).25 mg/L氟中毒小鼠睪丸生精細胞減少(見中插彩版圖4B),100 mg/L氟化鈉可導致生精細胞排列紊亂、各級生精細胞減少(見中插彩版圖4C).氟對睪丸組織的損傷存在劑量效應關系,隨著氟化物的增加,曲細精管的損傷程度越明顯.

3　討論

睪丸組織主要是由生精細胞、支持細胞、間質細胞組成,從上皮基部到腔面依次為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子.睪丸內有大量彎曲的曲細精管,其是產生精子的場所,良好的睪丸組織、結構對于精子的發生和生理功能的維持具有決定性意義.如果曲細精管內生精上皮受到化學毒物的影響,精子發生將出現障礙.

圖1　不同濃度氟的小鼠曲細精管細胞層數(A)、厚度(B)

圖2　不同濃度氟的小鼠曲細精管管腔半徑(A)、面積(B)

圖3　不同濃度氟的小鼠曲細精管半徑(A)、面積(B)

研究證明,氟是一種具有生殖毒性的微量元素.當體內氟蓄積到一定的濃度,會突破了血睪屏障,對睪丸的生精功能產生毒副作用[5].氟對大鼠睪丸生長發育的毒性試驗中組織病變包括精原細胞損傷,精原細胞減少,以及嚴重的睪丸超微結構的改變[6].飼喂含不同比例的燃煤型氟中毒病區煤烘玉米,發現大鼠睪丸生精小管發生不同程度的損害[7].Wan等[8](2006)用氟濃度為150 mg/L喂養大鼠50、80、100、120 d,隨著攝氟時間延長,小鼠生精上皮細胞層數目逐漸減少,曲細精管直徑越來越小.本試驗中高氟組小鼠的生精上皮細胞層數目減少,曲細精管管壁變薄同樣證實了這一觀點;而25 mg/L與100 mg/L氟化鈉組小鼠的管腔半徑、曲細精管半徑、曲細精管面積、曲細精管管腔面積并沒有顯著差異,可能與試驗動物的種類、攝氟的劑量、時間、方式有關系,還需做進一步試驗驗證.精子是精子發生的終末環節,我們前期研究發現氟暴露造成附睪中成熟精子頭、尾部中段不同程度的結構改變,尤以線粒體異常為主[9].本試驗通過睪丸形態計量學指標的測定和形態學觀察,證實氟中毒可導致小鼠曲細精管內生精細胞結構排列紊亂、細胞層數顯著減少、厚度變薄,睪丸結構基礎的破壞進一步引起功能的紊亂和喪失,最終造成不育的發生.

[1]王俊東.氟中毒研究[M].北京:中國農業出版社,2007.

[2]Doull J,Boekelheide K,Farishian B G,et al.Fluoride in Drink?ing Water:A Scientific Review of EPA's Standards[M].Washing?ton:National Academies.2006.

[3]Freni S C.Exposure to high fluoride concentrations in drinking water is associated with decreased birth rates[J].J Toxicol Environ Health,1994,42(1):109-121.

[4]Long H,Jin Y,Lin M,et al.Fluoride toxicity in the male repro?ductive system[J].Fluoride,2009,42(4):260-272.

[5]孫子龍,牛瑞燕,王俊東.氟對雄性小鼠生長發育及性腺中氟含量的影響[J].中國畜牧獸醫,2012,39(3):227-229.

[6]Sarkar S D,Maiti R,Ghosh D.Management of fluoride induced testicular disorders by calcium and vitamin-E co-administration in the albino rat[J].Reprod Toxicol,2006,22(4):606-612.

[7]肖躍海,孫發,李崇斌,等.燃煤型氟中毒對大鼠睪丸組織氧化應激效應的影響[J].中國醫學科學院學報,2011,33(4): 357-361.

[8]Wan S X,Zhang J H,Wang J D.Effects of high fluoride on sperm quality and testicular histology in male rats[J].Fluoride,2006,39(1):17-21.

[9]楊志強,王曉亞,曹鵬,等.氟對小鼠附睪中成熟精子超微結構的影響[J].中國畜牧獸醫,2014,41(8):137-140.

S859.8

B

0529-6005(2016)06-0102-02

2015-01-25

教育部高等學校博士學科點專項科研基金(2012-1403120005);山西省青年科技研究基金(2012021027-5);山西農業大學引進人才科研啟動項目(XB2010003)

林坤群(1993-),男,本科生,就讀于動物生殖毒理學專業學習,E-mail:405062446@qq.com

孫子龍,E-mail:sunzilong2000@163.com.