真空包裝鹽水鵝中腐敗細菌的分離鑒定

周　濤,余　娟,毛楊敏

(1.南京師范大學金陵女子學院,江蘇南京 210097;2.南京師范大學中北學院,江蘇南京 210046)

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真空包裝鹽水鵝中腐敗細菌的分離鑒定

周濤1,余娟1,毛楊敏2

(1.南京師范大學金陵女子學院,江蘇南京 210097;2.南京師范大學中北學院,江蘇南京 210046)

為了采取有效措施控制鹽水鵝中的微生物污染,遂先采用平板劃線分離方法分離出鹽水鵝中的主要微生物菌群,再根據革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實驗以及16S rDNA測序的方法對鹽水鵝中主要腐敗菌進行鑒定。結果表明,引起鹽水鵝腐敗變質的主要微生物菌群:菌種M為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,B.c)、菌種P為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens,P.f)、菌種S為成團泛菌(Pantoeaagglomerans,P.a)。

鹽水鵝,分離,鑒定,16S rDNA,腐敗菌

鹽水鵝作為現代健康食品,其鵝肉具有高蛋白,口味清淡,營養豐富,肉質細嫩,多不飽和脂肪酸,低膽固醇以及免疫球蛋白數量多的特點,因而一直成為加工綠色食品的理想原料。但是作為低溫肉制品,其在貯藏、運輸以及銷售過程中都極易因微生物的大量繁殖而引起產品的腐敗變質,導致肉制品腐敗變質的主要細菌包括:革蘭氏陰性菌,如需氧嗜冷假單胞菌(Pseudomonas)、氣單胞菌(Aeromonas)、不動桿菌(Acinetobacter)、莫拉氏菌(Moraxella)和腐敗交替單胞菌(Altermonas)、腸桿菌(Enterobacteriaceae);革蘭氏陽性菌,如葡萄球菌(Staphylococcus)、熱殺索絲菌(Brochothrixthemosphacta)[1]、乳桿菌(Lactobaci11us);革蘭氏陽性芽孢桿菌,如蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等,厭氧梭狀芽孢桿菌,如腐敗梭菌、溶組織梭菌和產氣莢膜梭菌等[2-3],從而影響產品的貨架期。因此,就如何控制鹽水鵝中微生物的污染、延長其貨架期已成為企業迫切需要解決的問題[4]。目前,國內外已報道的關于鵝肉制品方面的研究主要集中在風味和品質保鮮上,對鵝肉制品中的主要菌相的分離鑒定鮮有報道[5-6]。本研究采用平板劃線分離方法分離純化出鹽水鵝中的優勢微生物菌群,再根據革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實驗以及16S rDNA[7-8]測序的方法對鹽水鵝中的主要腐敗菌進行菌種鑒定,從而為靶向控制加工過程中的微生物污染提供依據,以達到延長貨架期的效果[9]。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鹽水鵝為真空包裝,生產日期為2014年06月04日,批號為20140604,加工過程為分割,真空包裝,沸水殺菌(100 ℃,40 min),象山曙海大白鵝食品有限公司惠贈;營養瓊脂培養基蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2,121 ℃滅菌15 min;甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin agar Base,MYP)蛋白胨10 g,甘露醇10 g,牛肉粉1 g,氯化鈉 10 g,酚紅0.025 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2±0.1,分裝每瓶100 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養基冷卻至50 ℃,每瓶分別加入50%卵黃乳液 5 mL及多粘菌素B 10000 IU;假單胞CFC選擇性培養基(Pseudomonas CFC Selective Agar additives,CFC)明膠蛋白胨16 g,酸水解酪蛋白10 g,硫酸鉀10 g,氯化鎂1.4 g,瓊脂12 g,甘油10 g,蒸餾水1000 mL,pH7.1±0.2,分裝每瓶200 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養基冷卻至50 ℃,每瓶加入一支假單胞菌CFC選擇性培養基添加劑,混勻,備用;腸道菌計數瓊脂培養基(Violet Red Bile Dextrose Agar,VRBDA)酵母粉3 g,蛋白胨7 g,氯化鈉5 g,葡萄糖10 g,膽鹽1.5 g,結晶紫0.002 g,中性紅0.03 g,瓊脂13 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃滅菌15 min,pH7.3±0.2;PCA平板計數瓊脂胰蛋白胨 5.0 g,酵母浸粉 2.5 g,葡萄糖1.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0±0.2;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、PCR引物的合成以及DNA序列的測定上海生工生物工程技術服務有限公司;其余試劑為分析純,南京化學試劑有限公司。

CJ-2S超凈工作臺天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠;LRH-250A生化培養箱廣東省醫療器械廠;DHP-9162恒溫培養箱太倉市科教器材廠;TH2-C恒溫搖床太倉市實驗設備廠;CH30-313顯微鏡江南光電股份有限公司;DYY-5穩壓電泳儀、DYCP-31DN DNA電泳槽北京六一儀器廠;PCR儀2720 thermal cyclerApplied Biosystems;FR980凝膠成像儀上海復日科技儀器有限公司;DK-8D電熱恒溫水槽上海一恒科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1腐敗菌的分離純化將鹽水鵝貯藏在4 ℃冰箱中6個月,直到出現例如鹽水鵝包裝袋內液體增多、肉質變軟、脹袋以及失去彈性等腐敗現象,將其從冰箱取出。

在無菌操作條件下,用無菌剪刀從鵝肉表面取樣25 g,剪碎后加入到225 mL 0.1%蛋白胨無菌生理鹽水中,隨后搖床振蕩30 min混勻,再取1 mL上清液進行加倍遞增稀釋到10-6,每個稀釋度做3個重復,傾注平板計數。選擇3個合適的稀釋度,接種于不同的選擇性培養基上,將培養出的不同菌落形態的菌種進行標號。

從平板上挑選出長勢良好、典型生長的菌落,然后再在各自的選擇性培養基上進行反復劃線分離純化,直至得到最終純化的單菌落。

1.2.2培養及形態特征菌落培養特征:菌落形狀;菌落顏色;菌落大小;菌落表面(表面光澤、表面性狀等);邊緣形狀(光滑、樹枝狀、波狀、缺刻狀等);隆起程度;透明程度;菌落質地。

菌體形態特征:菌體形狀;革蘭氏染色(紅色、紫色、陽性、陰性);芽孢;鞭毛等。

1.2.3生理生化特征糖發酵實驗,V-P實驗,吲哚實驗,H2S實驗,接觸酶實驗,石蕊牛乳實驗,甲基紅(M.R)實驗,Hugh-Leifson實驗,硝酸鹽還原實驗,淀粉水解實驗,脲酶實驗,明膠液化實驗,檸檬酸鹽利用實驗,油脂水解實驗,精氨酸脫羧酶實驗,苯丙氨酸脫氨酶實驗,L-酪氨酸分解實驗,0.001%溶菌酶實驗,酪蛋白水解實驗,厭氧洋菜實驗,動力實驗等[10]。

1.2.4DNA的提取與純化采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒直接提取單菌落DNA。

1.2.516S rDNA目標片斷的PCR擴增以提取的基因組DNA為模板,選用細菌通用引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′。選用25 μL體系進行聚合酶鏈式PCR反應。PCR 反應條件為:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,共30個循環,72 ℃延伸1 min,72 ℃修復延伸10 min,4 ℃終止反應。擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR擴增產物,并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.616S rDNA 序列的比對將測得的16S rDNA序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上使用BLASTN程序在GeneBank基因庫上進行同源性檢索,然后選取相似性較高的代表菌株的16S rDNA序列,與測得的菌株用ClustalX1.83校準排齊后進行多序列比較,用MEGA 3.1軟件進行多重比較后以鄰位連接法構建系統發育樹(Bootstrap=1000)。

2　結果與分析

2.1鹽水鵝中分離出的菌種

4 ℃貯藏條件下,從鹽水鵝中分離出的腐敗菌為菌種M、P、S及其它,且菌種M、P、S這三種菌占總菌落數的百分比比較大,見表1。因此可以判斷菌種M、P、S為鹽水鵝中的主要腐敗菌。

表1　4 ℃貯藏溫度下從鹽水鵝中分離出的菌種Table 1　 Strains isolated from salted goose at 4 ℃ storage temperature

圖1　革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000×)Fig.1　The microscopy of gram staining(1000×)

通過革蘭氏染色實驗及芽孢染色實驗初步分析這三種分離出來的細菌。結果見圖1、圖2以及表2。從圖1中可以看出菌種M為革蘭氏陽性菌,菌種P和菌種S為革蘭氏陰性菌。從圖2中可以看出菌種M有芽孢,可以初步判定為芽孢桿菌。根據表2的結果,可以看出三種菌株的基本特性,從而為對其進行進一步的鑒定實驗提供了依據。

圖2　芽孢染色顯微鏡觀察(1000×)Fig.2　The microscopy of spore staining(1000×)

菌種MPS菌落培養特征菌落形狀不規則狀圓形圓形菌落顏色粉紅色乳白色乳白色菌落大小較大較小較小表面光澤無有無表面性狀粗糙干燥光滑粘稠光滑邊緣形狀缺刻狀整齊整齊隆起程度扁平隆起隆起透明程度不透明不透明不透明菌落質地軟軟、濕潤軟、濕潤菌體形態特征形狀桿狀較短短桿狀桿狀革蘭氏紫色紅色紅色染色G+G-G-芽孢有無無鞭毛有有有

注:“+”表示陽性,“-”表示陰性。

2.2生理生化實驗

菌種M、P、S的主要生理生化特征見表3。結合革蘭氏鏡檢、菌株特性、生理生化實驗以及伯杰氏菌種鑒定手冊[11],初步可以鑒定出菌種M為芽孢桿菌(Bacillus)[12],菌種P為假單孢菌(Pseudomanas),菌種S為腸桿菌(Enterobacter)[13]。

表3　三種菌種的主要生理生化特征Table 3　Main physiological and biochemical characteristics of three species

注:“+”表示陽性,“-”表示陰性,“ND”表示未檢測,“O/F”表示氧化/發酵。

2.3菌種16S rDNA的PCR擴增

菌種的16S rDNA PCR擴增后進行1%瓊脂糖凝膠電泳實驗,結果如圖3所示,得出長度在1500 bp左右的明亮條帶,因此,PCR擴增后的16S rDNA的長度大約為1500 bp。

圖3　1%瓊脂糖電泳結果Fig.3　Electrophoresis results with 1% agarose gel 注:M* 泳道為DNA Marker。 1、2、3號泳道分別為菌種M、P、S的PCR條帶。

2.4系統發育分析

將分離出的菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中同源性較高的菌株的16S rDNA序列進行多序列比較后構建系統發育樹,結果見圖4。由同源性比較可得:M與蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)的同源性最高;P與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的同源性最高;S與成團泛菌(Pantoeaagglomerans)的同源性最高。

圖4　系統發育樹Fig.4　Phylogenic tree based on 16S rDNA sequence

蠟狀芽孢桿菌是一種好氧性、具有較強的耐受力、可以形成芽孢的革蘭氏陽性桿菌,因而在鹽水鵝加工過程中難以將其完全殺滅,殘存的菌種大量生長繁殖后將會影響產品的貨架期。雷鳴[14]等人對市售某3個品牌的在架真空包裝冷藏肉制品樣品進行嗜冷菌和中溫菌的微生物檢測,而后利用16S rDNA序列分析鑒定出其中的優勢菌群。研究結果表明:芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、葡萄球菌屬Staphylococcus這三類菌為冷藏肉制品樣品中的主要優勢菌屬,條件致病菌蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌在3個品牌產品中均有較高檢出率。

假單胞菌是導致食品腐敗變質的主要微生物,亦是冷藏肉中存在的優勢菌[15],這是因為假單胞菌在低溫條件下也能利用葡萄糖迅速生長繁殖使肉制品腐敗變質影響貨架期,由于鹽水鵝加工熟制后是在4 ℃條件下貯藏,因此有利于嗜冷性假單胞菌的生長繁殖。薛黨辰[16]等研究表明4 ℃存放過程中的鹽水鵝的菌群變化,最終是由假單胞菌屬履行著腐敗的進程。蔣云升[17]等研究了鹽水鵝貯藏在不同溫度下的菌落總數、pH以及菌相的變化。研究表明,當有異味產生時,此時的菌落總數達106cfu/g、腿肌的pH在6.5以上。此外,37 ℃時的腸球菌屬和葡萄球菌屬、20 ℃時的變形桿菌屬、4 ℃時的假單胞菌屬為鹽水鵝腐敗過程中的優勢菌種。

成團泛生菌屬腸桿菌科的泛菌屬,其廣泛存在于自然界中,如植物的體表、體內以及土壤中,在生產加工操作過程中受到污染或者在加工過程中使用了各種香辛料都可能會導致鹽水鵝中存在此類菌種,所以嚴格規范加工操作流程以及規范對香辛料的篩選也變得尤為重要[18-20]。

3　結論

從貯藏在4 ℃溫度下的鹽水鵝中分離出主要腐敗菌,經反復純化后將其分別命名為菌種M、P、S,通過革蘭氏染色鏡檢,芽孢染色鏡檢,菌落形態的觀察以及生理生化實驗。初步判斷菌種M為芽孢桿菌,菌種P為假單胞菌、菌種S為腸桿菌。然后提取細菌的16S rDNA,進行PCR擴增后,經測序和序列比對,得到最終的鑒定結果,菌種M為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、菌種P為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、菌種S為成團泛菌(Pantoeaagglomerans)。這些細菌正是容易引起食品腐敗變質的常見污染菌,并且在肉制品的熟制加工后仍有殘存,最終大量生長繁殖,引起鹽水鵝感官品質下降,從而影響其貨架期。綜上所述,本實驗研究結果與前人已發表的一些相關論文得到了類似的結果,進一步為加工過程中采取針對性的措施控制微生物污染提供借鑒和參考,另外就蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌以及成團泛菌如何污染鹽水鵝及其生長規律還有待進一步研究。

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Isolation and identification of spoilage bacteria in vacuum-packed salted goose

ZHOU Tao1,YU Juan1,MAO Yang-min2

(1.Ginling College,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China;2.Zhongbei College,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China)

To understand the microbial contamination of salted goose,some effective measurements were taken. Firstly,the primary bacterial flora was isolated from salted goose by the streak plate separation method. Secondly,it was identified on the basis of gram microscopy,strain characteristics,physio-biochemical tests as well as 16S rDNA sequence analysis.The results indicated that the Bacteria M asBacilluscereus,Bacteria P asPseudomonasfluorescensand Bacteria S asPantoeaagglomerans. All of them were the the primary bacteria in salted goose.

salted goose;isolation;identification;16S rDNA;spoilage

2016-01-18

周濤(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:zhoutaoo@sina.com。

TS207.4

A

1002-0306(2016)14-0219-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.036