免疫磁珠法分離純化乳鼠腎血管周細胞*

王 麗，馬躍榮（成都中醫藥大學附屬醫院病理科，四川成都610036）

·論 著·

免疫磁珠法分離純化乳鼠腎血管周細胞*

王 麗，馬躍榮
（成都中醫藥大學附屬醫院病理科，四川成都610036）

目的 通過建立腎原代細胞培養，探討免疫磁珠分離純化乳鼠腎血管周細胞的方法。方法 選取健康BALB/c乳鼠腎臟，剪碎、消化和過濾制成細胞懸液，原代培養并傳代（傳3代）。免疫磁珠法分離出神經膠質細胞2型硫酸軟骨素糖蛋白（NG-2）；倒置相差顯微鏡觀察細胞形態特點，免疫細胞化學檢測NG-2、平滑肌肌動蛋白（SMA）和CD31表達，BrdU法檢測細胞增殖活性，鑒定是否符合周細胞特征及純化后的細胞是否具有增殖活性。結果 純化后獲取的細胞寬大扁平，形態呈梭形、三角形或多邊形并有突起。細胞核橢圓居中，多為單核，偶為雙核，細胞質豐富，無接觸性抑制生長，符合周細胞形態及生長特征。NG-2和SMA免疫細胞化學染色陽性表達，CD31免疫細胞化學染色陰性表達，符合周細胞特點。分離純化后的細胞48、72 h細胞增殖率分別為（0.37±0.11）%、（0.42±0.10）%。結論 免疫磁珠法可使周細胞從細胞成分復雜的腎組織中分離出來，并具有生物活性，可繼續體外培養，為后續研究提供參考依據。

免疫磁珠法； 周細胞； 腎小管； 分離和提純

血管周細胞又稱Rouget細胞，是由Zimmermann于1923年首次提出，緊鄰內皮細胞，生理情況下與內皮細胞一起維持著內環境穩定［1］。周細胞存在于血管管壁，在不同器官中數量存在明顯差異，視網膜中分布較多，腎小管周毛細血管中也有發現。有文獻報道，有關在腫瘤和視網膜病變中周細胞較多，少數器官纖維化病變中偶見報道［2］。有學者提出腎間質纖維化發生機制與周細胞-間葉細胞轉分化相關［3］，該觀點一經提出便吸引眾多學者目光。周細胞在腎臟病變中的研究多處于體外實驗階段，這就需要純凈的、具有生物活性的周細胞作為實驗基礎，目前，沒有商品化的周細胞株出售，給研究帶來不便，所以找到一種可行、高效的獲取周細胞的方法是解決研究的首要問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康BALB/c乳鼠（由成都中醫藥大學實驗動物中心提供）30只，每只約3 g，雄雌不限。

1.1.2 試劑及儀器 DMEM/F12培養基（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），進口胎牛血清（美國Sigma公司），Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司），胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術研究所），免疫磁珠二抗（德國美天妮公司），神經膠質細胞2型硫酸軟骨素糖蛋白（NG-2，美國Abcam公司），平滑肌肌動蛋白（SMA，美國Abcam公司），CD31（美國Abcam公司）。超凈工作臺（成都恒瑞實驗設備有限公司），CO2培養箱（山東科博有限公司），電熱恒溫水浴箱（重慶東悅儀器公司），TD5K臺式低速離心機（上海趙迪生物科技有限公司），CKX31/41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），免疫磁珠分選儀（德國美天妮公司）。

1.2 方法

1.2.1 腎原代細胞培養 取1～3 d BALB/c乳鼠經頸椎脫臼法處死，經75%乙醇消毒后移入超凈工作臺，在無菌條件下解剖取腎，經含雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）PBS漂洗、剪碎、消化后，用含10%胎牛血清DMEM/F12培養基終止消化，收集細胞懸液。將細胞懸液離心，重懸后置于37℃，5%CO2培養箱原代培養，細胞生長72 h左右后換液。當細胞鋪滿80%培養皿底部時，傳代并拍照保存。

2.2 細胞純化 將收集的細胞通過免疫磁珠分選技術，獲得少量呈懸浮狀的單個透明細胞。48 h時，可見細胞貼壁生長，細胞輪廓清晰可辨。4 d時，生長狀態良好的細胞成群分布，細胞寬大扁平、三角形或多邊形伴3～5個突起，細胞核呈橢圓居中，單核或雙核，細胞質均質透明，相鄰細胞間連接緊密（圖3）。10 d后細胞生長旺盛，呈交叉重疊狀，出現無接觸抑制性生長。純化后細胞出現的形態特征和生長特點均與周細胞相符。

那夜老趙三回來得很晚，那是因為他逢人便講亡國，救國，義勇軍，革命軍，……這一些出奇的字眼，所以弄得回來這樣晚。快雞叫的時候了！趙三的家沒有雞，全村聽不見往日的雞鳴。只有褪色的月光在窗上，三星不見了，知道天快明了。

攔河壩壩軸線地基為土巖雙層結構，上部覆蓋層以卵石、含壤土碎石為主，最大厚度12.4m；下部基巖主要為全、強、弱風化泥巖和砂巖，其中全風化層厚度1～11m?？紤]攔河壩瀝青混凝土心墻為壩體防滲關鍵部位，以盡量減少瀝青心墻沉降，設計瀝青心墻坐落于強風化基巖上、基礎按深入強風化巖不少于1.0m控制。

2.1 細胞培養 倒置相差顯微鏡觀察細胞顯示，原代培養36 h，培養皿中細胞大部分貼壁，少許透亮細胞懸浮于培養基中；48 h時，通過首次換液及差異培養，培養皿底的細胞碎片等雜質成分減少，背景變得干凈，同時貼壁細胞數量明顯增多，輪廓分明；3 d時，培養皿底貼壁細胞散落分布，細胞扁平有向外伸展趨勢（圖1）；5 d時，貼壁細胞單層平鋪延伸，胞體明顯增大，形狀有所差異，胞核圓形或橢圓形居中，細胞質清晰，內含細小顆粒（圖2）；7 d時，貼壁細胞生長密集，呈編織狀外觀；當培養皿底鋪滿約80%細胞時傳代，傳代（傳3代）細胞與原代細胞形態相同。

2.3 純化細胞鑒定 將收集的細胞爬片后行免疫細胞化學染色，可見NG-2、SMA抗原表達，細胞質呈棕黃色顆粒細胞達95%以上，未見CD31抗原表達（圖4）。

摘 要：閘述傳統文化晨讀之內容，闡明傳統文化晨讀之意義。首先，學生的知識儲備量得以提高；其次，對學生正在形成的人文思想具有正面、積極的影響作用；第三，學生的詩詞鑒賞能力得以提高。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

where S is the entropy, N is the number of carriers, and U is the internal energy.

1.2.2 細胞分離純化 貼壁細胞經消化及離心后成細胞懸液，收集于離心管中，經緩沖液洗滌，移入EP管中。加一抗稀釋液（1∶50 NG-2）100 μL于EP管中吹打，孵育。洗滌、離心后加入免疫磁珠二抗（1∶4稀釋）孵育。洗滌、離心后緩沖液重懸。將細胞懸液通過在磁場中的分選柱，用緩沖液沖洗后移離磁場，加緩沖液洗脫獲取周細胞，在培養基中培養。

2 結 果

1.2.3 免疫細胞化學檢測 收集細胞懸液，制作12張爬片（實驗組NG-2/SMA/CD31各3張，陰性對照組各1張），加入0.3%過氧化氫溶液，37℃孵育，消除內源性過氧化物酶，洗滌。實驗組及陽性對照組（由成都中醫藥大學附屬醫院病理科提供的供性白片）分別滴加NG-2、SMA、CD31一抗，陰性對照組加PBS，孵育后加入二抗標記。DAB顯色、脫水、封片，拍照。

圖1 原代細胞培養3 d的貼壁細胞形態（40×）

圖2 原代細胞培養5 d的貼壁細胞形態（200×）

定植后應及時中耕除草，植株進入旺盛生長期應經常澆水，保持土壤濕潤。苦瓜生長期長，結瓜多，需肥量大，定植前應施足底肥。通常每667平方米施入優質農家肥5000千克，配合施用過磷酸鈣25千克，硫酸鉀10千克，深翻耙平，并開廂作畦。育苗移栽比直播提早7～10天上市，而且產量高。幼苗長至2～3片真葉時可移栽。春季栽培，植株蔓葉生長旺盛，側蔓較多，且掛果以側蔓為主，必須適當疏種，移植時一定要淋足定根水。

圖3 周細胞4 d時的細胞形態（200×）

1.2.4 細胞活性檢測 收集細胞懸液，制作10張爬片（48、72 h各5張），4%多聚甲醛室溫固定，用含0.3% Triton X-100的PBS漂洗，經0.3%過氧化氫溶液37℃孵育，阻斷內源性過氧化酶，漂洗、變性，0.1 mol/L硼酸（pH=8.0）中和，0.3%Triton X-100 PBS漂洗，山羊血清封閉孵育，滴加Anti-BrdU抗體4℃過夜；二抗室溫孵育。DAB顯色、蘇木素復染、雙蒸水洗滌，脫水、封片，光鏡下觀察，照相保存。40倍鏡下隨機選取6個非重疊視野，分別計數陽性細胞及總細胞個數，計算增殖率。

圖4 免疫細胞化學染色（200×）

2.4 細胞增殖活性檢測 分離純化后的細胞培養48、72 h，經Anti-BrdU抗體孵育，40倍鏡下計數，48 h培養組細胞增殖率為（0.37±0.11）%；72 h培養組細胞增殖率為（0.42±0.10）%，2個時間點比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

血管周細胞是體內微血管系統的重要組成之一，緊鄰內皮細胞，與內皮細胞間通過密切連接維持相互的穩定性，構成了微血管和組織間隙的基本屏障。有文獻報道，周細胞是一種原始的間充質細胞，因此，在某些特殊情況下，周細胞存在轉分化的可能性［2］。長期以來，在腎間質纖維化發生機制中，腎小管上皮細胞-間葉細胞轉分化學說占主導地位，但復雜的機制可能還有其他解釋，相關研究一直在持續［4-5］。2008年，新近學者在腎間質纖維化機制研究中提出了周細胞-間葉細胞轉分化學說，該學說一經提出便引起諸多學者的關注、跟進［5］。因此，隨著研究的深入，周細胞逐漸成為新的切入點。

本實驗原代細胞培養采用酶消化法，直接取乳鼠腎組織進行體外培養，因細胞剛從組織分離，且傳代數較少，所以可以最大限度地保持細胞原有生物學特性。作者認為整個實驗細胞無污染是成功的關鍵，所以本實驗中，在遵守無菌操作原則基礎上，盡量減少污染概率，為實驗的成功提供保障。乳鼠在有菌環境中被處死，經75%乙醇浸泡消毒30s，可減少皮膚表面細菌，移入超凈工作臺中解剖獲取腎組織，并經含有雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100 μg/mL）的PBS反復沖洗及含雙抗（同上）的培養基培養，均可最大限度地降低污染的概率。本實驗采用酶消化法，如何選擇合適的酶，獲取盡量多的具有活性的細胞尤為重要，所以作者在預實驗中用胰蛋白酶、胰蛋白酶聯合Ⅰ型膠原酶及Ⅰ型膠原酶分別消化腎組織塊，反復實驗得出，Ⅰ型膠原酶消化細胞存活率高，消化時間易于把握，可以作為本實驗的消化酶。

腎臟細胞組成復雜，原代培養混有內皮細胞、系膜細胞和纖維細胞等，要獲取純凈的周細胞，需要對其進行篩選。實驗中常用的分選方法有流式細胞技術、離心分離技術及免疫磁珠分選技術等。有資料顯示，流式細胞技術耗時長、易污染［6］，后期培養細胞存活率低。離心分離技術包括沉淀離心、差速離心和密度梯度離心等，離心時間長，對細胞產生的機械性損傷較大，對操作者技能要求較高，雖然可以成功分離靶細胞，但對細胞生物活性影響較大，不利于后期研究［7］。免疫磁珠法設備簡單，操作便捷，其最大優勢是可在超凈工作臺中實現無菌操作，對細胞損傷小，分選后細胞易存活［8］。其原理是基于抗原抗體結合反應，將帶磁珠的抗體與靶細胞表面抗原順利結合，利用磁場中的磁性吸附帶磁珠的靶細胞，從而達到分離靶細胞的目的。目前在視網膜及淋巴細胞等研究中得到廣泛運用，王應利等［9］已成功通過免疫磁珠分選法原代分離視網膜微血管周細胞，而用于分離腎臟周細胞卻鮮見報道，作者嘗試用該方法分離。

在本實驗中，作者通過原代和傳代培養使細胞增殖，利用周細胞相對特異的表面抗原蛋白NG-2，選用帶有NG-2抗體的磁珠，將靶細胞從細胞懸液中分離出來。純化后的細胞貼壁生長，細胞寬大扁平，形態梭形，三角形或多邊形并伴長短不一突起。細胞核呈橢圓居中，單核或雙核，細胞質略微豐富。10 d后，密集的細胞表現出無接觸性抑制生長方式。有研究報道，周細胞可表達α-SMA、平滑肌肌球蛋白、NG-2等，但不表達內皮細胞標志物，說明對于周細胞的鑒定，需要聯合抗原檢測［10］。根據周細胞表面抗原特點，本實驗聯合應用NG-2、SMA和CD31 3種抗體進行免疫細胞化學檢測，發現獲得的細胞NG-2、SMA抗原陽性表達，CD31抗原陰性表達，綜合觀察得出，分離獲得的細胞特征與Nicosia等［11］及Smith等［12］對周細胞研究報道相符。分離純化后的周細胞48、72 h增殖率為（0.37±0.11）%、（0.42±0.10）%，具有較強的增殖活性。以上實驗表明，原代細胞培養后，通過以抗原-抗體結合反應為基礎的免疫磁珠分選技術分選，不僅可獲得高純度的血管周細胞，還可因操作簡單、無污染，最大限度地減少對細胞活性的影響，作為獲取純化腎血管周細胞的一種可行方法，從而為腎血管周細胞的進一步研究奠定堅實基礎。

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Isolation and purification of sucking mice pericytes by immunomagnetic bead techniques*

Wang Li，Ma Yuerong
（Department of Pathology，Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，Sichuan 610036，China）

Objective To establish the primary culture by renal cells and to investigate the isolation and purification method of sucking mice renal vessel pericytes by the imunomagnetic bead technique.Methods The kidney of healthy BALB/c sucking mice was selected，cut into pieces，digested and filtered for preparing the cellular suspension.The primary culture and passage（3 generations）were performed；the mimunomagnetic bead technique isolated neurogliocytes（NG-2）；the inverted phase contrast microscope was adopted to observe the cellular morphological characteristics，the immunohistochemistry was used to detect NG-2，SMA and CD31 expression by joint judgement，the cellular proliferation activity was detected by using the BrdU method.Whether meeting pericytes characteristics and whether purified cells having the proliferation activity were identified.Results The cells obtained by purification were wide and flat，the morphologies were fusiform，triangle or polygon with prominence.The cellular nucleus was ellipse and in the middle，the majority were mononucleus，occasionally bi-neucleus，with plentiful cytoplasma，without contacting inhibition growth，which conformed to the pericytes morphology and growth characteristics.NG-2 and SMA were positively expressed by immunocytochemical staining，CD31 was negatively expressed，which conformed to the pericytes characteristics.The 48，72 h proliferation activities of isolated and purified cells were（0.37±0.11）%and（0.42±0.10）%respectively.Conclusion The imunomagnetic bead method can make the pericytes to be isolated from the kidney with complex cellular compositions，which have biological activity，can continuously culture in vitro and provide the reference basis for subsequentstudy.

Immunobead method； Pericytes； Kidney tubules； Isolation and purification

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.16.001

A

1009-5519（2016）16-2453-03

四川省衛生廳科技資助項目（80173）。

王麗（1984-），碩士研究生，主要從事腎臟病理的研究。

2016-05-11）