一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究

唐雅茹,國立東,2,王娜娜,霍貴成,*

(1.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江中醫藥大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150040)

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一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究

唐雅茹1,國立東1,2,王娜娜1,霍貴成1,*

(1.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江中醫藥大學藥學院,黑龍江哈爾濱 150040)

本實驗采用鄰苯二甲醛法篩選出一株體外降膽固醇能力強的植物乳桿菌KLDS1.0386,該菌分離自中國內蒙古地區傳統發酵乳制品,測定了其對酸和膽鹽的耐受性以及對Caco-2細胞的黏附能力。結果表明,篩選出的植物乳桿菌KLDS1.0386的降膽固醇能力達到55.71%;在pH3.0的酸性環境中培養3 h的存活率為84.62%;在0.3%的膽鹽環境中培養3 h的存活率為83.65%,并且該菌的黏附能力也很強,黏附率達到16.65%,說明植物乳桿菌KLDS1.0386能通過胃進入腸道并保持活性,而且能在腸道很好的定植,所以,該菌可以用做降膽固醇的潛在益生菌。

植物乳桿菌,降膽固醇,耐酸,耐膽鹽,黏附

隨著生活水平的提高,人們的飲食結構發生了很大的變化,隨之而來的是,患有高血壓、冠心病等心血管疾病的人越來越多,有研究指出,血清中膽固醇含量的減少有助于降低心血管疾病的發生率[1]。近年來,益生菌的降膽固醇作用越來越受到人們重視[2],尤其是乳桿菌,其體外降膽固醇能力以及益生功能被廣泛研究[3-4]。2010年,HUANG Y等人從基因水平上證實了嗜酸乳桿菌的降膽固醇機理,為乳桿菌的降膽固醇功能奠定了理論基礎[5];2012年,JONES M L等人利用羅伊氏乳桿菌發酵酸奶,成人飲用后血清中的膽固醇含量明顯降低[6],在體內證實了乳桿菌的降膽固醇作用。本實驗從內蒙古傳統發酵乳制品中分離出5株乳桿菌,從中篩選出一株降膽固醇能力強的植物乳桿菌,并對其耐酸、耐膽鹽、黏附方面的特性進行研究,以為開發具有降膽固醇功能的發酵乳提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

BCN1360型生物潔凈工作臺北京東聯哈爾儀器公司;氮吹儀寧波新芝生物科技股份有限公司;DU800紫外分光光度計美國Beckman公司;DHP-9082型電熱恒溫培養箱上海一恒科技有限公司;TGL-16G離心機上海安亭科技儀器廠;滅菌鍋上海三申醫療器械有限公司。

95%乙醇天津市富宇精細化工有限公司;鄰苯二甲醛、冰乙酸、巰基乙酸鈉上海惠世生化試劑有限公司;牛膽粉、膽固醇Sigma。乳桿菌培養基MRS培養基;膽鹽培養基:在MRS培養基中添加0.3%牛膽粉和0.2%的巰基乙酸鈉;高膽固醇培養基在膽鹽培養基中添加1%的膽固醇。

表1　幾株菌的膽固醇去除率

注:同列數據肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

5株乳桿菌均分離自內蒙古傳統發酵乳制品,經過16SrDNA測序鑒定分別為:嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、植物乳桿菌KLDS1.0386、植物乳桿菌KLDS1.0317、植物乳桿菌KLDS1.0318;鼠李糖乳桿菌LGG,教育部乳品重點實驗室保存。

1.2實驗方法

1.2.1降膽固醇能力測定采用鄰苯二甲醛法[7-8]來測定5株乳桿菌的降膽固醇能力。將菌液以2%的接種量接種于高膽固醇培養基中,以未接菌的高膽固醇培養基為空白對照,在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后,將菌液離心,采用鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇的含量[9],降膽固醇能力以(空白組-實驗組)/空白組來表示。

1.2.2耐酸實驗首先用1 mol/L鹽酸將液體MRS培養基的pH分別調為2.0、3.0,121 ℃滅菌15 min,然后將傳代培養好的菌液(菌液中菌的濃度為3×109CFU/mL)以2%(v/v)的量分別接種于該培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養,分別在1、2、3 h無菌取出100 μL菌液稀釋,并涂布于MRS瓊脂平板中。培養24 h后計算菌落數(以log CFU/mL表示)。以普通液體MRS(pH6.2)中涂布后的菌落數為對照,計算存活率[10]。公式為:存活率=N0/Nt,N0代表低pH的菌落數,Nt代表普通MRS的菌落數。

1.2.3耐膽鹽實驗首先配制膽鹽培養基,121 ℃滅菌15 min,以普通液體MRS為對照。將活化培養好的菌液(菌液中菌的濃度為3×109CFU/mL)以2%的量接種于培養基中,于37 ℃恒溫培養,分別在1、2、3 h無菌取出100 μL培養液,用滅菌的生理鹽水稀釋涂布,37 ℃恒溫培養24 h后菌落計數(以log CFU/mL表示)。以普通液體MRS(pH6.2)中涂布后的菌落數為對照,計算存活率。公式為:存活率=N0/Nt,N0代表膽鹽培養基的菌落數,Nt代表普通MRS的菌落數。

1.2.4黏附實驗在細胞六孔培養板中用DMEM培養液(含胎牛血清和雙抗)孵育Caco-2細胞,于37 ℃二氧化碳培養箱(5% CO2、相對濕度95%)中長至單層貼壁生長后進行實驗[11]。

將培養15 h后的菌液(濃度為3×108CFU/mL)在4 ℃離心機中離心(10000 g,10 min),用已滅菌的PBS緩沖液清洗菌體3次,再重懸于等體積的PBS中;同時,用PBS緩沖液清洗細胞2次后,分別加入菌液0.5 mL、DMEM培養液0.5 mL,輕微混勻后至于37 ℃二氧化碳培養箱中,1 h后,用PBS緩沖液清洗細胞,除去未黏附的細菌[12],加入1 mL的胰酶使得細胞懸浮,再進行稀釋涂布平板,以等體積未加入與細胞共培養的菌液涂布作為陽性對照。每個處理做3個平行。

2　結果與討論

2.1降膽固醇實驗

2.1.1膽固醇標準曲線圖1是膽固醇標準曲線,線性方程為:y=1.8774x-0.0252,R2=0.9967,線性關系良好,可以用于降膽固醇能力的測定。

圖1　膽固醇標準曲線Fig.1　The standard curve of cholesterol

2.1.2菌的降膽固醇能力經鄰苯二甲醛法測定的5株菌的降膽固醇能力如表1所示,5株菌的體外降膽固醇能力很強,都高于45%,其中KLDS1.0318的膽固醇去除能力最低,為46.79%,其次是植物乳桿菌KLDS1.0317、嗜酸乳桿菌KLDS1.1003,其中植物乳桿菌KLDS1.0386的膽固醇去除率最高,為55.71%,與居華[13]、胡夢坤[14]等分離出的植物乳桿菌相比,膽固醇去除率相對較高。因此菌株KLDS1.0386被篩選出進行益生功能的測定。

2.2篩選菌株的酸耐受性

益生菌在體內主要定值在腸道部位,因此要想對身體發揮有益作用,首先必須要耐受酸性的胃環境,胃液的pH在飲食前后是有變化的,正常人在空腹時胃液pH為2以下,進食后pH達到3左右[15],食物在胃中的消化停留時間大不相同,一般在3 h以內胃才會排空[16]。所以本實驗選定2個pH,分別為2.0和3.0;3個時間點,分別為1、2、3 h,來檢驗KLDS1.0386能否耐受胃酸環境。由圖2可知,植物乳桿菌KLDS1.0386在pH2.0條件下耐受性很差,但在pH3.0條件下3 h以內耐受性很強,存活率分別為92.89%、91.04%、84.62%,因此,此菌株具有很好的胃酸耐受能力。

2.3篩選菌株的膽鹽耐受性

人體腸道的膽鹽濃度通常維持在0.3%左右,菌的膽汁耐受力是保證其在腸道存活的先決條件[17]。因此本實驗選用濃度為0.3%的膽鹽培養基,來檢驗KLDS1.0386的膽鹽耐受情況。結果如圖3所示,植物乳桿菌KLDS1.0386在0.3%膽鹽濃度下培養3 h的存活率為83.65%,說明該菌對膽鹽具有較強的耐受力,為該菌能在腸道內存活提供了理論基礎。

圖3　植物乳桿菌KLDS1.0386對膽鹽的耐受性Fig.3　Tolerance of L. plantarum KLDS1.0386 to bile salt

2.4篩選菌株的黏附能力

益生菌對身體發生益生作用的前提是必須能黏附在上皮細胞或腸粘膜表面[18],因此,益生菌對腸上皮細胞的黏附能力已經成為評價其益生特性的重要指標之一。本實驗選用人體結腸癌細胞系Caco-2細胞,該細胞貼壁生長,當植物乳桿菌KLDS1.0386與其共培養時,能黏附在細胞邊緣,且該菌的形態保持完整,植物乳桿菌KLDS1.0386的黏附能力很強,黏附率為16.65%,是陽性對照菌LGG(5.8%)的2.87倍。由此可知,菌株不同,其黏附能力也大不相同,有研究指出,乳桿菌對腸道的黏附能力與其表面蛋白、上皮粘液及其自身性能等有重要聯系[19]。本實驗證實了植物乳桿菌KLDS1.0386具有在腸道定植的潛力,為該菌的實際應用提供了理論基礎。

表2　2株乳桿菌的黏附率

3　結論

本實驗首先采用鄰苯二甲醛法對5株乳桿菌進行了體外降膽固醇能力的測定,幾株菌的降膽固醇能力都超過了45%,其中,植物乳桿菌KLDS1.0386的降膽固醇能力高達55.71%,因此被選出進行益生功能的測定。本研究對該菌的耐酸、耐膽鹽以及黏附能力進行了測定,在pH3.0的MRS培養基條件下培養3 h后,該菌的存活率依然可以達到84.62%;對0.3%膽鹽的耐受率達到83.65%;對結腸癌Caco-2細胞的黏附率為16.65%。由以上可知,植物乳桿菌KLDS1.0386具有很強的體外環境耐受能力,同時也具備很強的體外降膽固醇能力,為進一步研究植物乳桿菌KLDS1.0386的降膽固醇機理提供了先決條件,也為開發具有降膽固醇功能的發酵乳奠定了理論基礎。

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Screening and study on Probiotic characteristics of a Cholesterol-lowering lactobacillu

TANG Ya-ru1,GUO Li-dong1,2,WANG Na-na1,HUO Gui-cheng1,*

(1.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,college of pharmacy,Harbin 150030,China)

A Lactobacillus plantarum KLDS1.0386 which has the good cholesterol reducing effect was screened By O-phthalaldehyde. It was isolated from traditional dairy products in Inner Mongolia of China. In this study,viable count was used to detect the tolerance characteristics under MRS environment pH2.0,pH3.0,0.3 g/100 mL bile salt,and the ability to adhere to Caco-2 cells. The results showed that the cholesterol-lowering rate of Lactobacillus plantarum KLDS1.0386 was 55.71%,the tolerance rate in pH3.0 was 84.62%,and the 0.3% bile salt resistant rate was 83.65%. Additionally,the adhere rates was 16.65%.So,Lactobacillus plantarum KLDS1.0386 can pass the stomach into the intestines,keep active,and colonize in the gut. In conclusion,Lactobacillus plantarum KLDS1.0386 could be as the probiotics with cholesterol-lowering activity.

Lactobacillus plantarum;cholesterol-lowering;acid tolerance;bile salt resistant;

2015-05-19

霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術，E-mail:yarutang@126.com。

唐雅茹(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail:gchuo@126.com。

國家自然科學基金；國家863項目(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000