乳腺癌細胞三維培養模型構建及其藥物敏感性研究

姜昊聲　曹　燕　吳紹秋　劉冰妍　賈一平　王振磊　尚鳴異

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·基礎研究·

乳腺癌細胞三維培養模型構建及其藥物敏感性研究

姜昊聲曹燕吳紹秋劉冰妍賈一平王振磊尚鳴異

目的觀察乳腺癌MCF-7細胞在3D與2D培養模式下對阿霉素的敏感性。方法應用模板印制凝膠微孔支架技術建立體外3D細胞培養模型，通過倒置顯微鏡等方法觀察3D細胞球的生長特性；采用AlamarBlue法獲得不同培養模式下藥物阿霉素作用的細胞抑制率；采用流式細胞術比較2D培養和3D培養細胞周期、細胞凋亡的差異。結果3D與2D培養相比，G1/G0期胞增多，S期、G2/M期細胞減少，細胞周期受阻滯，具有統計學差異(P<0.05)；活細胞減少，早期凋亡、晚期凋亡、壞死細胞比例增大(P<0.05)。阿霉素作用3 d后，3D培養細胞的IC50值為23.77 μg/ml [95% CI 15.80～35.77]，2D培養細胞的IC50值為0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75)，MCRI為51.7。結論3D培養MCF-7細胞在細胞周期、細胞凋亡等方面與2D培養細胞存在明顯差異，可能是導致乳腺癌多細胞耐藥的重要原因。

乳腺癌；腫瘤多細胞球；3D培養；阿霉素；抗藥性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:871～874)

近年來，3D細胞培養在藥物研究和生物學研究中的應用越來越廣泛。研究表明，相比于傳統的2D平面培養，在3D立體培養狀態中細胞的形態和功能更加貼近動物體內活細胞的真實生長狀況，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實情況。腫瘤多細胞球(multicellular tumor spheroids,MCTs)是1種經典的3D細胞培養模型，近似于腫瘤發生早期的無血管瘤或實體瘤組織中遠離血管的區域，其通過模擬腫瘤異質性結構、細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用，從而能模擬腫瘤組織的生理學特征[1-3]。MCTs已廣泛的應用于藥物篩選與作用機制研究。目前3D培養已有多種技術，如旋轉瓶技術(spinner flask)、生物反應器技術(bioreactor)[4]、瓊脂-液體覆蓋法(soft agar-liquid overlay)[5]、懸滴法(hanging drop)[6]、3D多孔支架(porous 3-D scaffold)等[7-8]，但這些方法存在一定的局限性，產生的細胞球大小差異大、大規模制備受限、細胞球收集困難，或者需要較先進的設備等。

本文中，利用凝膠微孔支架技術構建得到了MCTs，系統性觀察細胞球的生長變化，檢測乳腺癌MCF-7多細胞球的形成對阿霉素敏感性的影響，以及觀察細胞周期分布，細胞凋亡對腫瘤多細胞球耐藥產生的影響。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

胰蛋白酶、高糖DMEM培養基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清(Hyclone，美國)；阿霉素(Sigma，美國)；瓊脂糖、AlamarBlue細胞活性試劑盒(Invitrogen，美國)；細胞周期檢測試劑盒(碧云天，中國)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；酶標儀(TECAN，瑞士)；流式細胞檢測儀(BD，美國)；CO2培養箱(Thermo Fisher，美國)。人乳腺癌細胞系MCF-7由上海交通大學醫學院中心實驗室提供。

1.2方法

1.2.13D立體凝膠微孔支架的制備采用高分子材料模板[9]來制備3D立體凝膠微孔支架。主要步驟為：以滅菌后的2%瓊脂糖平鋪于培養板孔底部，再將模板印置于其上，待冷卻后移除模板，培養板孔底部遂形成含有大量一致孔徑的凝膠層，見圖1。細胞培養板紫外光照射2 h以備用。

A為制備凝膠微孔支架的模板，B為凝膠微孔支架，C為3D細胞球培養板

圖13D立體凝膠微孔支架制備

1.2.2細胞培養單層培養采用常規貼壁法，3D多細胞球培養應用凝膠微孔支架技術，主要步驟為：①消化對數期平面培養MCF-7細胞，制成4×105/ml的單細胞懸液；②用PBS和完全培養基依次潤洗3D細胞球培養板，排除微孔內氣泡；③取2 ml細胞懸液加入已用凝膠微孔支架鋪底的3D多細胞球培養板，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱內培養；④隔天換液。

1.2.3多細胞球生長觀察使用倒置顯微鏡觀察并照像記錄，應用ImageJ軟件進行多細胞球直徑(n=30)的計算。

1.2.4藥物敏感性測定收集對數期平面培養MCF-7細胞，調整單細胞懸液濃度，按2×104/cm2的密度接種于96孔板，每孔加完全培養基100 μL，置于孵箱中培養24 h。3D多細胞球按上述凝膠微孔支架方法，培養3 d。2D和3D培養系統各分為10組，每組4孔。對照組換普通培養液，9個實驗組各孔分別換含10-3、10-2、10-1、1、5、10、20、40、60 μg/ml阿霉素的培養液。于加藥后3 d行AlamarBlue檢測。各組分別更換培養液，每孔加入含10% AlamarBlue完全培養基，繼續孵育2 h。用熒光酶標儀測量各孔的熒光強度。根據測得的數值，以濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，應用GraphPad Prism 5.0軟件繪制藥物劑量反應曲線，計算50%抑制濃度(50% inhibition concentration，IC50)和多細胞耐藥指數(multicellular resistance index，MCRI)。

1.2.5細胞周期和細胞凋亡的測定將MCF-7細胞2D平面培養3 d，凝膠微孔支架培養6 d，分別酶解成單個細胞，收集，用預冷70%乙醇4 ℃固定12 h，碘化丙啶37 ℃避光溫浴染色30 min，流式檢測和FlowJo分析細胞周期分布。將2D平面培養3 d的MCF-7細胞，凝膠微孔支架培養8 d的MCF-7細胞球，分別酶解成單個細胞，收集，用500 μl結合液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后再加入5 μl的碘化丙啶，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，流式檢測和FlowJo分析細胞凋亡率。

1.3統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，數據以平均值±標準差形式呈現，采用獨立樣本t檢驗分析組間差異，P<0.05時具有統計學意義。

2　結果

2.1MCF-7細胞球的生長特點

用預制的模板來制備凝膠微孔支架，這一支架含有大量孔徑一致的微孔。當單細胞懸液均勻接種于凝膠微孔支架鋪底的3D多細胞球培養板時，細胞在微孔中相互聚集，形成多細胞聚集體，多個細胞聚集體在細胞連接的作用下開始融合，形成邊界光滑連續的多細胞球；隨著培養時間的加長，細胞球外層細胞的增殖，球體邊緣開始變毛糙，球體體積逐漸增大；培養7 d后，大多數細胞球直徑和形態不再發生明顯的變化(圖2)。圖3顯示的是細胞球直徑變化曲線圖。細胞球形成后，直徑經過一個短暫的減小后逐漸的增大，大約一周后，直徑進入平臺期，不再明顯增大。應用凝膠微孔支架技術制備出的細胞球，大小較一致(SD≤ 10%)，且細胞連接牢固，可以通過移液槍吹打來大量的收集。圖4顯示的是培養3 d后收集的細胞球。

圖2　MCF-7細胞球生長變化圖

圖3　細胞球直徑變化曲線圖

圖4　凝膠支架上收集到的大量培養3 d后的MCF-7細胞球

2.23D與2D培養MCF-7細胞對阿霉素的敏感性

阿霉素對3D與2D培養MCF-7細胞劑量反應結果見圖5。與2D培養相比，各濃度組3D培養MCF-7細胞對阿霉素的藥物敏感性明顯降低，二者有顯著性差異(P<0.05)。隨著藥物濃度加大，3D與2D培養細胞抑制率都明顯升高。阿霉素作用3 d后，3D培養細胞的IC50值為23.77 μg/ml[95% CI 15.80～35.77]，2D培養細胞的IC50值為0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75)，MCRI 為51.7，可見3D培養細胞對阿霉素的耐藥性增加，這一結果與H?kanson 等[10-11]學者的研究結果一致。

2.33D與2D培養MCF-7細胞的細胞周期分布

應用流式細胞儀檢測2種培養系統下MCF-7細胞周期的分布，3D培養與2D培養相比，存在細胞阻滯，G1/G0期細胞增多，S期、G2/M期細胞減少，具有統計學差異(P<0.05)(表1)。

圖5　阿霉素對3D與2D培養MCF-7細胞劑量反應曲線

培養系統G1/G0SG2/M2D40.76±1.9049.44±2.635.81±0.303D59.48±3.10*30.70±2.52*4.42±0.17*

注：與2D平面培養比較，*為P<0.05。

2.43D與2D培養MCF-7細胞的細胞凋亡比較

應用流式細胞儀檢測2種培養系統下MCF-7細胞凋亡，3D培養與2D培養相比，活細胞減少，早期凋亡、晚期凋亡、壞死細胞比例增大，具有統計學差異(P<0.05)，見表2。

表2　3D立體和2D平面培養MCF-7細胞凋亡率比較/%

注：與2D平面培養比較，*P<0.05。

3　討論

目前，進行體外藥物敏感實驗一般采用傳統的平面培養，而體內藥物的作用靶點通常是具有一定組織結構的實體瘤，瘤體內細胞異質性明顯，在細胞與細胞、細胞與基質之間存在著廣泛的相互作用和相互影響，因而與單層培養的腫瘤細胞的生長狀態存在差異。腫瘤細胞體外三維培養可得到近似于體內腫瘤的組織結構，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實情況。而腫瘤多細胞球作為一種經典的3D細胞培養模型越來越受學者們的重視。本研究采用預制的模板制備立體凝膠微孔支架，對乳腺癌MCF-7細胞進行3D培養。當單細胞懸液接種于凝膠微孔支架鋪底的3D細胞球培養板時，細胞在微孔中相互聚集、融合，短時間內(24 h)就能自發形成腫瘤多細胞球。形成的細胞球大小也較一致(SD≤10%)，這對于在藥物研究中獲得可重復的結果非常重要。因制備的細胞球具有牢固的三維立體結構，我們能夠輕松的通過移液槍沖洗來收集，并對單個細胞球進行定性或者定量的分析。這一經凝膠微孔支架鋪底的3D細胞球培養板，能夠大規模的制備多細胞球，在高效藥物篩選中具有廣泛的應用前景，可進行商業化的生產。

腫瘤細胞耐藥是影響化療療效和患者預后的重要因素之一。本實驗結果顯示：阿霉素作用3 d后，3D培養細胞的IC50值為23.77 μg/ml，2D培養細胞的IC50值為0.46 μg/ml。3D培養MCF-7細胞對阿霉素的多細胞耐藥指數為51.7，與2D培養細胞相比，對化療藥物阿霉素明顯耐藥，表明實驗所建立的乳腺癌多細胞耐藥模型是成功的。

3D培養MCF-7細胞與2D培養細胞相比，細胞周期明顯阻滯于G1/G0期，可能是導致乳腺癌多細胞耐藥的重要原因。腫瘤多細胞球(直徑>200 μm)可分為邊緣增殖細胞區，中間靜止細胞區、中心壞死區[12]，這種異質性的細胞分布以及球樣體內的物質梯度極其類似于體內腫瘤微轉移灶、局部無血管腫瘤組織和實體瘤組織中遠離血管的區域。然而，MCTs內大量腫瘤細胞滯留在細胞周期某個時相點，除導致一些細胞周期特異性化療藥物失效外，由于其增殖緩慢，處于相對靜止或者靜止狀態，極易對其他許多化療藥物產生耐受[13]。結果還顯示，3D培養MCF-7細胞細胞凋亡率明顯升高，這一結果與Kim 等[13]學者的研究結果不一致。我們主要考慮以下原因：在培養8 d后進行凋亡檢測的細胞球直徑已經達到450 μm左右，球體直徑較大，球體中心區缺乏氧氣、營養、代謝產物堆積和低pH值，細胞發生較多的凋亡和壞死。

綜上所述，本實驗采用凝膠微孔支架技術，成功的建立了乳腺癌多細胞耐藥模型。近年來，許多對單層培養腫瘤細胞有較強殺傷作用的化療藥物在進行臨床試驗時往往不能達到理想效果，而MCTs中細胞形態和功能更加貼近動物體內活細胞的真實生長狀況，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實情況，在藥敏研究中應用前景光明。實驗中，發現3D培養乳腺癌細胞生物學特性和2D培養細胞相比發生明顯改變，特別是球體樣三維結構以及細胞間的相互作用可能是誘導多細胞耐藥的重要原因，其相關的機制有待進一步的研究。

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(編輯：吳小紅)

Fabrication of Three Dimensional Cell Culture Model of Breast Adenocarcinoma and Detection of Its Drug Resistance

JIANGHaosheng,CAOYan,WUShaoqiu,etal.

TongrenHospital,ShanghaiJiaotongUniversityofMedicine,Shanghai,200072

ObjectiveTo observe the changes of sensitivity to doxorubicin on breast adenocarcinoma MCF-7 cells cultured as 3 dimensional model or monolayer.MethodsMCF-7 cells were cultured as 3 dimensional model using agarose scaffolds with highly ordered micro-wells.The spheroid growth characterization was observed by invert microscope.The sensitivity to doxorubicin on MCF-7 spheroids or monolayers was determined by AlamarBlue assay respectively.Cell cycle and apoptotic rate were detected by flow cytometry.ResultsFor 3D spheroid culture,the proportion of cells in G0～G1phase was higher,while the proportion of cells in S phase and G2-M phase were lower than the 2D culture(P<0.05).The cell viability declined in 3D culture than the 2D control,and the proportion of cells in the early-apoptotic,late-apoptotic phase increased significantly(P<0.05).After 3 days of DOX treatment,the IC50value obtained for spheroid culture was 23.77 μg/ml [95% CI 15.80～35.77],relative to 0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75) for the monolayer culture.The MCRI value was 51.7.ConclusionThere are significant differences in cell cycle and apoptotic rate between MCF-7 spheroids and monolayer,which may be the important causes of the multicellular resistance of breast carcinoma.

Breast adenocarcinoma；Multicellular tumor spheroids；Three dimensional cell culture；Doxorubicin；Drug resistance

200072 上海交通大學醫學院附屬同仁醫院

尚鳴異

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.06.001

R737.9

A

1001-5930(2016)06-0871-04

2016-04-01

2016-04-24)