VEGF-C VEGFR-3對微淋巴管密度的影響及在宮頸癌中的作用

國宏莉 李江華? 王玨 殷姿

VEGF-C VEGFR-3對微淋巴管密度的影響及在宮頸癌中的作用

國宏莉 李江華? 王玨 殷姿

目的 探討宮頸癌組織及癌旁組織中VEGF-C及其受體的表達對微淋巴管密度的影響及其在腫瘤轉移中的作用。方法 采用免疫組化SP法利用抗人D2-40單克隆抗體標記100例宮頸疾病組織中的微淋巴管，并計算癌組織及癌旁組織的微淋巴管密度；采用SP法檢測癌組織及癌旁組織的VEGF-C及VEGFR-3蛋白表達，分析二者與微淋巴管密度的關系，評價其在宮頸癌浸潤、轉移中的作用。結果 D2-40在慢性宮頸炎組織上皮中強陽性表達，宮頸上皮內瘤變中表達逐漸減弱。VEGF-C及VEGFR-3隨著宮頸上皮內瘤變級別的增加，表達增強，二者呈高度正相關。結論 癌組織微淋巴管密度的增高與宮頸癌的浸潤與轉移密切相關，并伴有VEGF-C及受體表達的增強，是反映患者淋巴轉移和預后的良好指標。

宮頸癌 VEGF-C 微淋巴管密度 淋巴結轉移

宮頸癌是宮頸惡性腫瘤的統稱，鱗狀細胞癌和腺癌是宮頸惡性上皮性腫瘤的常見組織類型，約占宮頸癌＞90%。淋巴道轉移是宮頸鱗狀細胞癌和腺癌侵襲遠處器官的主要途徑之一，而宮頸癌的高病死率與淋巴結轉移密切相關。現已證實血管內皮生長因子（VEGF）及其家族成員不僅在腫瘤血管生成，在其它的生理和病理的血管及淋巴管生成中均是必不可少的誘導因子。VEGF-C是VEGF家族的重要成員，與受體VEGFR-3結合，在淋巴管內皮細胞表達。作者通過檢測宮頸癌組織及癌旁組織中VEGF-C/VEGFR-3蛋白表達情況，計算微淋巴管密度，分析VEGF-C/VEGFR-3對微淋巴管生成的作用，評價對宮頸癌轉移和預后的影響。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2009年11月至2013年10月在湖北醫藥學院附屬人民醫院及十堰市婦幼保健院手術切除宮頸組織標本100例，均經病理檢查證實。其中慢性宮頸炎8例；宮頸上皮內瘤變Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別12、10、20例；宮頸癌50例，按國際婦產科聯盟（FIGO，2000）標準分期，IB2期15 例、ⅡA期17例、ⅡB期18例；按WHO組織學類型分型：腺癌12例、鱗癌36例、腺鱗癌2例；病理分化程度：高分化 6例、中分化29例、低分化15例。術后證實無淋巴結轉移31例，有盆腔淋巴結轉移19例?；颊吣挲g25～71歲，平均43.7歲。所有宮頸癌患者術前均未放、化療治療，宮頸浸潤癌行廣泛全子宮切除及盆腔淋巴結清掃術。

1.2 試劑 即用型鼠抗人單克隆D2-40抗體（產品編號ZM-0465）、濃縮型兔抗人VEGF-C多克隆抗體（產品編號ZA-0266，工作濃度1：100）、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體（產品編號ZM-0277，工作濃度1：100）及通用型SP染色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化SP法 經中性福爾馬林固定、石蠟包埋的宮頸組織連續切片，厚4μm。采用免疫組化SP法檢測D2-40、VEGF-C、VEGFR-3的表達情況，操作步驟按試劑盒說明進行。采用枸櫞酸緩沖液高壓熱力修復抗原，DAB顯色，蘇木精復染。用已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.4 結果判斷標準 D2-40 染色陽性部位主要位于淋巴管腔面胞膜，形成形態不規則的管腔結構，內無紅細胞。微淋巴管密度（LVD）的判定參考Aishima等［1］的方法，低倍鏡下選擇微淋巴管豐富的區域，再轉換至高倍鏡下，隨機選擇5個視野，求其平均值，計算LVD。此操作均由兩名高年資病理醫師完成，取平均值。癌組織微淋巴管密度（I-LVD）及癌旁組織微淋巴管密度（P-LVD）分別判讀。VEGFR-3陽性染色主要位于腫瘤邊緣及間質微淋巴管內皮細胞質，VEGF-C陽性主要表達于癌細胞胞漿。

1.5 統計學方法 采用SPSS10.0 統計軟件。計量資料以（±s） 表示，用t檢驗。變量間的關系采用相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸組織中D2-40的表達 D2-40在宮頸組織中可表達于微淋巴管內皮細胞，也可表達于宮頸上皮組織（包括鱗狀上皮及腺上皮）的基底膜，一般為細胞漿表達（見圖1）。各宮頸疾病組織中微淋巴管均可被D2-40標記，鏡下呈棕黃色環狀結構。慢性宮頸炎中微淋巴管分布少，宮頸上皮內瘤變中微淋巴管數目逐漸增多，部分管腔擴張。在有淋巴結轉移的宮頸癌患者中，癌旁組織間見微淋巴管明顯增生。D2-40在慢性宮頸炎組織上皮中強陽性表達，宮頸上皮內瘤變中表達逐漸減弱。CINⅡ、CINⅢ級與宮頸浸潤癌均為陰性。

圖1 宮頸組織中D2-40的表達

2.2 宮頸組織中VEGF-C的表達 慢性宮頸炎中VEGF-C未見表達，隨著宮頸上皮內瘤變級別的增加，表達增強，尤其是CINⅠ、CINⅡ與CINⅢ比較差異有統計學意義（P＜0.01），而CINⅢ級與宮頸浸潤癌比較差異無統計學意義。VEGF-C主要表達于腫瘤細胞胞漿，局灶分布或彌漫（見圖2）。

圖2 宮頸組織中VEGF-C的表達

2.3 宮頸組織中VEGFR-3的表達 VEGFR-3陽性染色主要位于腫瘤邊緣及間質微淋巴管內皮細胞質，呈棕黃色環狀結構，部分在腫瘤細胞內也有表達。慢性宮頸炎中陽性淋巴管的數量較少；隨著宮頸上皮內瘤變級別的增加，陽性淋巴管的數量增加，尤其是CINⅠ、CINⅡ與CINⅢ比較差異有統計意義（P＜0.01），各組宮頸疾病間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 VEGF-C、VEGFR-3的表達與微淋巴管密度的關系 宮頸癌組織中隨著VEGF-C表達強度的增加，VEGFR-3陽性脈管數也明顯增加；而VEGF-C表達陰性者，VEGFR-3陽性脈管數較少。利用Spearman等級相關分析，VEGFR-3的表達與VEGF-C呈正相關 （r=0.753，P＜0.05 ）。另外，癌旁組織微淋巴管密度（P-LVD）與癌旁組織中VEGFR-3的表達呈正相關 （r=0.647，P＜0.05 ）。

3 討論

VEGF也稱血管通透因子 （VPF）或促血管因子（VAS），能特異性地直接作用于血管內皮細胞，是上調血管生成的重要因子?，F已證明有6種同源性的VEGF，為VEGF-A，-B，-C，-D，-E和胎盤生長因子（ PIGF）一起構成生成血管因子的VEGF家族。VEGFs尤其VEGF-C、-D，能特異性結合VEGFR-3，促使其磷酸化。VEGF-C與淋巴管上皮細胞有較高的化學親和性，可以誘導淋巴管上皮細胞增殖和淋巴管的生成，最終導致腫瘤淋巴管轉移。但VEGF-C的具體作用機制尚未清楚，有待于進一步研究［2］。

轉移是腫瘤侵襲性的重要特征，該過程必須穿過幾個屏障，最后在靶器官形成轉移瘤。腫瘤組織邊緣微淋巴管是腫瘤細胞進入淋巴系統的主要門戶，惡性腫瘤細胞主要是通過其周邊組織的微淋巴管進入淋巴系統轉移。近期有報道，聯合D2-40及p16INK4a檢測可有效鑒別宮頸上皮內病變，尤其是從宮頸CINⅡ及CIN Ⅲ中篩選出CINⅠ［3］。在對宮頸鱗狀細胞的研究中，有學者觀察50例患者癌組織中VEGF-C、VEGFR-3及血管生成素-1的表達，分析其與包括轉移等臨床病理特征的相關性，結果顯示微淋巴管生成與淋巴結轉移密切相關，而微淋巴管生成與VEGFR-3表達密切相關［4］。部分學者檢測宮頸腺癌中微血管密度及微淋巴管密度，結果表明二者在腫瘤的演進和淋巴結轉移中起重要作用，而癌旁組織中D2-40標記的微淋巴管密度可作為預測淋巴結轉移的獨立因素［5，6］。本資料顯示，VEGF-C、VEGFR-3隨宮頸病變組織級別的增高而表達增強，且與微淋巴管密度正相關，該結果進一步證實了上述研究。由此可見，VEGF-C在淋巴管內皮細胞表達，與瘤周淋巴管生成及淋巴結轉移顯著相關，這導致腫瘤細胞有更多的機會接觸淋巴管，而促進腫瘤細胞淋巴管轉移。

Mitsuhashi等［7］對宮頸癌患者血清治療前后VEGF-C和VEGF濃度比較，研究發現，VEGF-C在治療前高濃度，經手術或放療后，二者濃度明顯降低，治療前VEGF-C的高濃度與復發及頑固相關。同時，結果還顯示宮頸鱗癌血清濃度明顯高于正常人，而腺癌則未見明顯區別。另一項研究比較有無淋巴結轉移的宮頸癌患者中VEGF-C的表達情況，結果表明淋巴結轉移且有VEGF-C升高者，預后不良，1年生存率為38%，而無VEGF-C升高的淋巴結轉移者為81%，兩組差異有統計學意義［8］。上述研究揭示，在宮頸癌中VEGF-C能促進淋巴道轉移，是不良預后的指征。

雖然VEGF能促進腫瘤血管及淋巴管的生成，并可能影響機體的免疫調節功能。但該血管淋巴管不成熟、易滲漏、缺乏周圍血管的支持結構，故通過調節VEGF-C、-D和其他相應受體VEGFR-3為靶點抑制腫瘤轉移來治療宮頸癌改善預后，或抑制腫瘤血管的生長促進凋亡，或刺激免疫細胞，增強免疫功能等多途徑或治療方法。如VEGF-C可通過調控樹突狀細胞的成熟和聚集來影響腫瘤的免疫監視，故腫瘤微環境中的VEGF-C可能抑制與腫瘤相關的樹突狀細胞誘導抗腫瘤的免疫能力［9］。另一研究顯示［10］，通過抑制宮頸癌中VEGF的表達，能增強腫瘤的放射敏感性，從而影響腫瘤放療效果。而Katanyoo K等［11］的研究認為治療前血清VEGF的濃度與宮頸癌的臨床病理特征如分期分級、腫瘤大小或腫瘤對放療的療效等無明顯相關性。由此可見，目前應用分子生物學的方法干預腫瘤的轉移、免疫等來治療宮頸癌的途徑還存在一定分歧，有必要進一步的研究證實。

VEGF家族成員及受體作為惡性腫瘤淋巴管血管生成的促進因子，其作用機制是目前研究的熱點。隨著對VEGF作用機制研究的進一步深入，應用分子生物學手段及聯合應用傳統或更為先進的手段治療宮頸癌，一定會取得更好的治療效果。

1 Aishima Shinichi， Nishihara Yunosuke， Iguchi Tomohiro， et al.Lymphatic spread is related to VEGF-C expression and D2-40-positive myofibroblasts in intrahepatic cholangiocarcinoma. Modern Pathology， 2008， 21（3）：256～264.

2 Sotiropoulou N， Bravou V， Kounelis S， et al. Tumour expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression. Pathology， 2010，42（7）：629～636.

3 Hongxiu Han，Yan Yang，Zhouping Lu， et al.Decreased D2-40 and increased p16INK4A immunoreactivities correlate with higher grade of cervical intraepithelial neoplasia. Diagnostic Pathology，2011， 6：59.

4 Shaleen K. Botting， Hala Fouad， et al. Prognostic Significance of Peritumoral Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3 in Invasive Squamous Cell Cervical Cancer. Translational Oncology，2010，3（3）：170～175.

5 Saad RS， Ismiil N， Ghorab Z， et al. Lymphatic vessel density as a prognostic marker in clinical stage I endocervical adenocarcinoma. int J Gynecol Pathol，2010，29（4）：386～393.

6 Heinzelbecker J， Kempf KM， Kurz K， et al. Lymph vessel density in seminomatous testicular cancer assessed with the specific lymphatic endothelium cell markers D2-40 and LYVE-1：Correlation with pathologic parameters and clinical outcome. Urol Oncol，2013，31（7）：1386～1394.

7 Mitsuhashi A，Suzuka K，Yamazawa K，et al.Serum vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGF-C levels as tumor markers in patients with cervical carcinoma. Cancer ，2005，103 （ 4 ）：724～730.

8 Watanabe S， Kato M， Kotani I， et al.Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity： A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40， VEGF-C and VEGF-D.Yonago Acta Med，2013，56（1）：29～37.

9 Varney M L，Singh S ，Backora M，et al.Lymphangiogenesis and antitumor immune responses.Curt Mol Med，2009，9（6 ）：694～701.

10 Hu X， Xing L， Wei X，et al.Nonangiogenic function of VEGF and enhanced radiosensitivity of HeLa cells by inhibition of VEGF expression. Oncol Res， 2012，20（2-3）：93～101.

11 Katanyoo K， Chantarasri A， Chongtanakon M， et al.Pretreatment levels of serum vascular endothelial growth factor do not correlate with outcome in patients with locally advanced cervical cancer. Asian Pac J Cancer Prev， 2011，12（3）：699～702.

Objective To research the infl uence and function of the expression of VEGF-C and its receptor on density of lymphatic vessels in cervical cancer. Methods Paraffi n-embedded specimens from 100 patients with cervical diseases were used to measure the expression of VEGF-C and VEGFR-3，marked lymphatic vessels and count density of lymphatic vessels in cervical cancer by S-P immunohistochemical staining method. Results D2-40 was positive expressed strongly in chronic cervicitis tissues epithelium，and weaken gradually. in cervical intraepithelial neoplasia，VEGF-C and VEGFR-3 were enhanced expression with the increase of level of cervical intraepithelial neoplasia，both were highly positive correlation. Conclusion Increase of density of lymphatic vessels in cervical cancer and invasion is closely related to the metastasis，accompanied by VEGF-C and enhancement of the receptor expression，which is a good indicator refl ecting lymphatic metastasis and prognosis in patients.

Cervical cancer VEGF-C Density of lymphatic vessels Lymphatic metastasis

湖北省教育廳基金項目（B2013122；B2015476 ）

442000 湖北醫藥學院病理學教研室（國宏莉 王玨殷姿）

442000 湖北省十堰市太和醫院整形燒傷外科（李江華）