1,25-二羥基維生素D3通過誘導基質金屬蛋白酶7的表達上調小鼠腸道中活性防御素

陳子碩，劉　譽

（四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

1,25-二羥基維生素D3通過誘導基質金屬蛋白酶7的表達上調小鼠腸道中活性防御素

陳子碩，劉譽

（四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

為探索維生素D對腸道先天免疫抗菌肽——α-防御素1（alpha-1-defensin，DEFA1）剪切酶基質金屬蛋白酶7 （matrix metalloproteinase 7，MMP-7）的調控，利用維生素D受體基因敲除小鼠（Vitamin D receptor knock-out，VDR-KO）與腸道細胞系作為研究模型，通過免疫組化染色、qRT-PCR及免疫印跡等研究方法，發現其腸道細胞中MMP-7的轉錄水平與蛋白水平較野生型（wild type，WT）小鼠顯著降低，并且DEFA1的表達量也較低，表明維生素D可以調控腸道MMP-7的表達，從而影響DEFA1的成熟。同時，體外細胞實驗表明：1，25-二羥基維生素D3能夠上調腸道細胞MMP-7的轉錄水平和蛋白水平。初步表明，維生素D通過調控MMP-7的表達影響DEFA1的成熟，而維生素D缺失，MMP-7下調從而DEFA1下調，進一步可能造成腸道菌群失調，導致多種慢性疾病的發生。

1，25-二羥基維生素D3；維生素D受體基因敲除鼠；基質金屬蛋白酶7；α防御素

0　引言

維生素D（VD）是一種調節鈣磷代謝的主要維生素，在免疫以及癌癥、疾病感染、組織纖維化、脂肪肝和酒精肝的防治中具有重要作用［1］。大量臨床數據表明，維生素D在多種慢性疾病中普遍缺失［1］。維生素D的活性形式為1，25-二羥基維生素D3，通過與維生素D受體（VDR）結合行使功能。VDR是核受體家族的重要轉錄因子，與特異VDR順式元件（VD response element，VDRE）結合后，被激活的復合體招募到共激活因子或抑制因子，從而促使或抑制特定基因的轉錄［2］。

大量研究表明，VD能夠影響多種免疫細胞的分化、成熟，抑制Th1反應中IL-2、IL-12和IFN-γ等促炎癥因子的表達［3］，誘導T調節細胞的產生［4］，促進Th2反應IL-4、IL-5和IL-10等抑炎癥因子的表達［5］。本課題組前期研究表明，在Balb/C小鼠中VDR在皮膚、小腸、肝臟和胰島中均有表達，尤其在腸道的表達量最高，約為皮膚的20倍，胰腺的100倍，肝臟的1000倍。臨床數據和研究發現，VD能夠抑制腸道炎癥［6］，抑制腸道纖維化［7］和腫瘤［8］的產生和發展，促進腸道上皮細胞緊密連接蛋白的表達［9］，維持腸道潘氏細胞功能［10］等，這些表明腸道是VD作用的重要器官，VD在維持腸道穩態中具有重要作用。

潘氏細胞位于小腸利氏腺窩的基部［11］，在受到膽堿和腸道微生物刺激時，會分泌大量α-防御素（α-defensin，DEFA）及其他抗菌分子和促炎癥因子，如溶菌酶、磷脂酶a2、白介素17和腫瘤壞死因子等［11-12］。DEFA是一類由6個高度保守二硫鍵連接的半胱氨酸骨架陽離子多肽［13］。在小鼠的小腸中，潘氏細胞受到細菌產物刺激時，DEFA在腺窩處的局部濃度可達到25～100mg/mL，是腸道先天免疫的主要成分［14］。在潘氏細胞中，基質金屬蛋白酶7（MMP-7）是特異剪切DEFA的酶，DEFA前體N端經MMP-7剪切后，暴露其帶有正電荷的活性區域，形成約3.5kD的活性DEFA［15］。研究表明，MMP-7基因敲除小鼠的腸道無法對前體DEFA進行剪切，從而缺乏活性形式的DEFA，使腸道對細菌感染高度敏感，在低劑量的致病菌鼠傷寒沙門氏菌的感染下，MMP-7基因敲除的小鼠與對照組小鼠相比死亡更多、更快［16］。維生素D對腸道的免疫調節非常重要，但其對MMP-7的作用機制仍不清晰。本文檢測了維生素D對DEFA活性剪切酶MMP-7的表達調控，從一個新的角度出發探討維生素D對腸道免疫的調節作用。

1　材料與方法

1.1材料

Caco2細胞由中國科學院細胞庫提供，HT29細胞由本實驗室保存。DMEM高糖（Hyclone）培養基，含10%胎牛血清 （Clark），1%青霉素-鏈霉素雙抗（Thermo）。1，25-二羥基維生素D3，購于SIGMA公司。雜合子維生素D受體基因敲除小鼠B6.129S4-Vdr＜tm1Mbd＞/J（006133），購于美國Jackson Lab。小鼠飼料：高磷高鈣飼料，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。VDR抗體（12550），購于Cell Signaling Technology；MMP-7抗體（sc-8832），購自Santa Cruz Biotechnology；GAPDH抗體購于成都正能生物科技公司；α-defensin 1抗體由南加州大學凱克醫學中心Yoshihiro Eriguchi提供。山羊抗兔IgG-HRP（sc-2004），山羊抗小鼠IgG-HRP（sc-2005），和驢抗山羊IgG-HRP（sc-2020）均購于Santa Cruz Biotechnology。通用型山羊抗兔檢測試劑盒（PV-6000），山羊二步法超敏檢測試劑盒 （PV-9003），DAB檢測試劑盒（ZLI9017）均購于北京中杉金橋公司。TRizol試劑購于Transgen公司；反轉錄試劑盒購于羅氏公司；熒光定量試劑購于Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1VDR基因敲除小鼠的鑒定與飼養

將購于美國Jackson Lab的VDR基因敲除雜合子小鼠雌雄1∶1兩兩配對進行交配。約3～4周后，雌鼠產下小鼠。待F1代小鼠斷奶后（約3周），將其從母鼠處分出至新的籠子內，按雌雄分開。剪取小鼠尾尖約0.5～1cm，提取基因組DNA并進行PCR，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。所使用的引物為Mutant：5′-CACGAGACTAGTGAGACGTG-3′；Wild type：5′-CTCCATCCCCATGTGTCTTT-3′；Common：5′-TTCTTCAGTGGCCAGCTCTT-3′。凝膠顯影后，只有一條500bp大小條帶的為VDR基因敲除純合子，有兩條分別為382bp和500bp條帶的為雜合子，只有一條382bp大小的條帶為野生型小鼠。所有小鼠均飼養在獨立通氣籠具（IVC）系統中，25℃恒溫，12h晝夜交替飼養，小鼠飼料和飲水供給充足，動物飼養與實驗完全遵守美國國立衛生研究院（NIH）頒布的實驗動物管理使用條例的規定。

1.2.2免疫組織化學染色

將新鮮的小鼠回腸取出，從前段剪取約1cm長度，用4%多聚甲醛4℃固定24～48h，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋、切片。將野生型和VDR基因敲除小鼠的回腸切片置于二甲苯中脫蠟兩次，每次10min，然后分別置于100%，95%，75%酒精各5min，流水沖洗；將回腸切片置于抗原修復液中，煮沸15～20min。根據所檢測抗原等電點的不同，檢測VDR、MMP-7時使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），檢測DEFA1時使用Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0）；然后用3%雙氧水處理10min，水洗，0.3%Triton X-100穿孔10min，PBS洗3次，每次5min；3%BSA室溫封閉1h，根據抗體使用說明配置一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次；二抗室溫孵育1 h，PBS洗3次；DAB顯色，置于顯微鏡下觀察顯色程度，水洗終止顯色；蘇木精復染，水洗，酒精梯度脫水，干燥后用中性樹脂封片，倒置顯微鏡明場拍照檢測。

1.2.3細胞培養與處理

Caco2細胞和HT29細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基于5%CO2，37℃培養箱中培養。將細胞按照5×105接種于六孔板中，待細胞至60%～70%匯合度時，更換為無血清DMEM培養基，血清饑餓12h；然后吸去培養基，更換為含1%胎牛血清的DMEM培養基，實驗組加入100nmol/L的1，25-二羥基維生素D3、對照組加入相同體積的乙醇作為陰性對照，處理24h。收集細胞，提取RNA或蛋白質，進行后續qRT-PCR和Western blot檢測。

1.2.4qRT-PCR檢測MMP-7基因的表達

在收集的細胞或組織樣本中加入TRizol，按照說明書步驟進行RNA提取，隨后立即取1g總RNA按照羅氏的反轉錄試劑盒進行反轉錄，將所得的cDNA稀釋5倍后，作為模板，利用熒光定量試劑進行qPCR，檢測MMP-7的表達。待測基因引物序列如下：人CYP24al上游引物：5′-CGACTACCGC AAAGAAGGCTA-3′，下游引物：5′-ACCATTTGTTCA GTTCGCTGT-3′；人MMP-7上游引物：5′-GTTTAGA AGCCAAACTCAAGG-3′，下游引物：5′-CTTTGACA CTAATCGATCCAC-3′；人GAPDH上游引物：5′-CC TGGAGAAACCTGCCAAGTAT-3′，下游引物：5′-CTC GGCCGCCTGCTT-3′。小鼠MMP-7上游引物：5′-GCAGAAGTTCTTTGGCCTGC-3′，下游引物：5′-TA TCCGCAGTCCCCCAACTA-3′；小鼠RPL-19上游引物：5′-GAAGGTCAAAGGGAATGTGTTCA-3′，下游引物：5′-CCTTGTCTGCCTTCAGCTTGT-3′。qRTPCR反應體系為20.0 μL，反應條件：95℃預變性30 s，95℃ 10s，60℃ 30 s，總共40個循環，采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達

細胞總蛋白提取：將細胞培養基棄盡，用預冷的1×PBS漂洗2～3次，用細胞刮將細胞盡數刮下，4℃800g離心10min收集細胞。棄盡PBS后加入適量的RIPA（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；150 mmol/L NaCl；1.0%Triton X-100；0.1%SDS；PMSF 1mmol/L）裂解液于冰上，每10 min渦旋震蕩30 s，30 min后，4℃最大轉速離心30min，吸取上清，即細胞總蛋白。所得蛋白用BCA法測得濃度，隨后加入5×SDSPAGE上樣緩沖液，于金屬浴中100℃加熱10min。然后將制得的蛋白樣品于12%的SDS-PAGE進行電泳，4℃轉于PVDF膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，ECL顯影成像。

2　結果

2.1DEFA1在VDR-KO小鼠的回腸中表達量降低

VDR基因敲除（VDR-KO）小鼠通過基因打靶技術，在VDR基因第2個外顯子內插入一段序列，使VDR基因不能正常翻譯表達［17］。親代雜合子小鼠交配后，通過PCR檢測子代小鼠的基因型（見圖1），分別鑒定出VDR-KO小鼠（VDR-/-）、雜合子小鼠（VDR+/-）和野生型（WT）小鼠（VDR+/+）。

圖1　子代小鼠基因型鑒定

免疫組化染色表明，VDR-KO小鼠的回腸中無陽性著色區域（見圖2），而WT小鼠回腸內VDR主要分布在腸腺窩和絨毛中，并且VDR主要分布于細胞核。為了研究VDR對腸道防御素DEFA1的影響，利用免疫組化染色，在WT小鼠和VDR-KO小鼠中檢測了DEFA1的表達情況。如圖2所示，VDR-KO小鼠回腸腺窩底部的DEFA1表達量較WT小鼠顯著降低。

2.2DEFA1的活性剪切酶MMP-7在VDR-KO

小鼠中表達降低

在小鼠的腸道中，DEFA的成熟、活化及分泌主要由MMP-7介導［15］。在VDR-KO小鼠中DEFA1的下調可能是由其剪切酶MMP-7的下調引起的。因此利用免疫組化染色和qRT-PCR發現，與WT小鼠相比，VDR-KO小鼠回腸中MMP-7蛋白與mRNA表達量降低，并且具有顯著差異（見圖3）。初步表明，在VDR-KO小鼠中，MMP-7的表達量降低，造成MMP-7對DEFA1的剪切作用減弱，使得DEFA1的表達量下調。

2.31，25-二羥基維生素D3在腸道細胞系中上調MMP-7

為了驗證VD-VDR能夠調控MMP-7的表達，選取兩株人腸道細胞系進行體外實驗。通過qRTPCR檢測發現，經過100 nmol/L 1，25（OH）2VD3處理后，VDR下游的靶基因CYP24al表達量顯著增加，在Caco2細胞中約增加2000倍，HT29細胞中約增加300倍（見圖4（a））。同時1，25（OH）2VD3處理后，MMP-7的mRNA表達量于Caco2細胞和HT29細胞中均顯著上調（見圖4（b））。此外，利用Westernblot檢測發現，VDR和MMP-7的蛋白水平顯著上調（見圖4（c）），初步表明1，25（OH）2VD3通過上調VDR，進而上調MMP-7的表達。

圖2　DEFA1在VDR基因敲除小鼠回腸中的表達量降低

圖3　MMP-7在VDR基因敲除小鼠回腸中的表達

3　討論

在前期的實驗中發現，飲食缺乏VD的小鼠和VDR-KO小鼠腸道存在慢性炎癥，并且腸道菌群的組成也發生顯著變化。推測這種改變與腸道防御素的下調相關。腸道防御素對腸道表皮干細胞具有保護作用，可以防止多種有害菌定殖在腺窩處［18］。小腸腺窩處的防御素含量約有毫克級，而防御素在微克級便可發揮其抗菌活性，所以這些防御素足以有效保護腺窩［19］。小腸中的微生物含量與結腸微生物的比例約為1∶104到1∶106，防御素給小腸提供了一個抗菌的環境，使得臨近大腸的菌群沒有過多的定殖到小腸中［20］。由于對防御素的敏感性不同，腸道菌群中各種菌的相對豐度有所差異，所以腸道菌的分布與菌群構成部分受到防御素的支配［21］。防御素還具有旁路信號分子作用，如小鼠的隱窩素3，可引起鹽和水的分泌反應［22］，還可以誘導白介素8（IL-8）的分泌［23］。在之前的實驗中發現，小鼠灌胃α-防御素5 （DEFA5）后，可以重新平衡飲食介導的VD缺失小鼠腸道菌群。

圖4　1，25-二羥基維生素D3在腸道細胞系中上調MMP-7

研究證明維生素D可以直接誘導防御素的表達［24］，如人的β防御素2、3和4，在其啟動子上具有VDR順式元件（VDRE）［25］。然而單純的VD并不能夠明顯誘導其表達，需要NF-B通路的共同作用［26］。在實驗中發現，VD并不能明顯的誘導DEFA的表達，而更多的是通過調控MMP-7從而調控活性形式的DEFA表達量。在人體中，與小鼠防御素直系同源人的防御素前體主要是由胰蛋白酶的異構體剪切［14］。而通過實驗結果推測，在人體中MMP-7也同樣能夠剪切DEFA介導其成熟。此外，MMP-7作為一種基質金屬蛋白酶，其在多種外分泌和粘膜表皮中表達，如皮膚，唾液腺，胰腺，肝臟，乳腺，腸道，泌尿生殖道和肺等［27］，其底物包括一些細胞外基質組分如纖連蛋白、明膠、IV型膠原、層黏連蛋白和彈力蛋白等。MMP-7對它們的剪切導致基質分解，這對細胞的遷移和組織的重構十分重要［27］。研究表明，在組織損傷、修復過程中，MMP-7通過剪切趨化因子CXCL1抑制炎癥反應［28］，剪切E-cadherin等細胞粘附蛋白促進傷口邊緣細胞遷移［29］，從而促進傷口修復。因此，研究結果也暗示了VD可能通過調控MMP-7從而促進組織損傷修復。通過生物信息學分析，我們發現在MMP-7基因的啟動子區域-1285位和-1006位，存在VDR結合作用元件——VDRE序列。因此推測，維生素D可能是通過VDR/VDRE作用于MMP-7的啟動子，在轉錄水平上調控MMP-7的表達，因此需要進一步實驗證明。

4　結束語

VD在腸道免疫中具有重要的作用，本文發現通過誘導MMP-7的表達可增加腸道免疫成分DEFA的表達量，從而調節腸道菌群，這為以后腸道菌群以及腸道免疫相關疾病的治療提供了新的思路。

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（編輯：莫婕）

1，25（OH）2VD3up regulates activation of α-defensins through induction of MMP-7 in mouse intestine

CHEN Zishuo，LIU Yu
（College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

The aim of this study was to find the role of VD in regulating the active form of αdefensin 1（DEFA1），one of the antibacterial peptides in mouse intestine.It showed that the active DEFA1 was much lower in VDR knock-out mice compared to the wild type（WT）mice. Both mRNA and protein of matrix metalloproteinase-7（MMP-7），the cleaved enzyme of DEFA1，as detected by immumohistochemical staining and qRT-PCR，were at a relatively low level.In vitro experiment showed that VD can induce the expression of MMP-7 in colon cells.Thus，it suggested that VD can regulate the expression of MMP-7.When VD was deficient，MMP-7 was down-regulated and so was the active form of DEFA1，it might lead to impairment of intestinal innate immunity and dysbiosis and drive chronic disorders.

1，25（OH）2VD3；Vitamin D receptor knock-out mice；matrix metalloproteinase-7；αdefensin

A

1674-5124（2016）08-0057-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.08.012

2016-03-20；

2016-04-25

陳子碩（1990-），女，江蘇徐州市人，碩士研究生，專業方向為代謝綜合征、腸道菌群細胞生物學。