干旱脅迫對轉擬南芥　AtP5CS1基因羽衣甘藍光合特性的影響

李大紅，李 偉，邵海闊（黃淮學院生物工程系；黃淮學院園林中心，駐馬店463000）

干旱脅迫對轉擬南芥AtP5CS1基因羽衣甘藍光合特性的影響

李大紅1，李 偉1，邵海闊2
（1黃淮學院生物工程系；2黃淮學院園林中心，駐馬店463000）

以轉擬南芥AtP5CS1基因羽衣甘藍和野生型（對照）為試驗材料，在水分脅迫0d、2d、4d、6d和復水2d、4d條件下，研究水分脅迫和復水后葉片的氣體交換、葉綠素熒光參數、葉綠素含量的變化特征。結果表明：隨著水分脅迫天數的增加，轉基因羽衣甘藍的葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）、水分利用效率（WUE）、Fv/Fm等指標的下降幅度均小于對照，氣孔限制值（Ls）和非光化學猝滅系數（NPQ）上升的幅度小于對照，說明轉基因羽衣甘藍的光系統在水分脅迫時受到的傷害程度要小于對照；復水后轉基因羽衣甘藍的光合參數、葉綠素熒光參數、葉綠素含量等迅速恢復，而對照的光合參數及其他參數恢復緩慢。在水分脅迫條件下，轉基因羽衣甘藍能保持良好的光合特性，復水后具有良好的生理補償效應，是適應干旱環境的重要生理因素。

羽衣甘藍；轉基因；抗旱性；光合特性；對比試驗

植物在干旱或鹽滲透脅迫下，植物生長被抑制，生物量或產量下降，造成農業減產和經濟損失。目前研究認為，植物會對逆境產生抵制作用，這種抗逆機制可能是脯氨酸（Pro）和甘氨酸等一些低分子量物質在滲透中起調節作用［1-4］。脯氨酸在滲透平衡中的作用可能是防止細胞膨壓增加［5］。1-5-吡咯啉羧酸合酶（P5CS）是脯氨酸合成的限速酶。目前，P5CS基因已經在一些植物中被分離出來，其中最早被分離出來是豇豆P5CS基因。但不同物種中，P5CS基因可能有多個，他們的作用也是不同的［6］。例如，甘藍型油菜中有兩個P5CS基因（BnP5CS1和BnP5CS2），而且他們都能由脫落酸、鹽和PEG誘導而表達增加［7］。但在擬南芥中，脫落酸、鹽和干旱僅可誘導AtP5CS1的表達，而AtP5CS2不受影響［8］；在高等植物中，脯氨酸的積累可能是由其合成增加或分解減少。然而，如果脯氨酸合成關鍵酶P5CS的活性增加，其產物脯氨酸的生物合成將會增加，植物的抗逆性將會增強［9-11］。把一種植物的P5CS基因轉到另一種植物中，可以增加脯氨酸的含量，如KAVI等［12］把VaP5CS在煙草中過表達，在干旱脅迫條件下轉基因植株比非轉基因親本的脯氨酸含量增加，生物量也相應增長，也有人把PuP5CS轉入煙草，其具有抗寒性［10］。其他類似的研究如馬鈴薯［13］、水稻［14-15］和小麥［16］。本研究組把擬南芥AtP5CS1基因轉到羽衣甘藍中，羽衣甘藍中P5CS的表達顯著增加，轉基因植株在干旱迫脅下，株高、根長以及存活率等指標顯著高于對照［17］。研究干旱脅迫下轉基因羽衣甘藍的光合特性變化，探討干旱脅迫下轉基因羽衣甘藍與野生型的光合作用差異及與其耐旱性強弱，可為了解P5CS功能及培育羽衣甘藍新品種提供參考。

1　材料與方法

1.1樣品處理

轉擬南芥AtP5CS1基因羽衣甘藍T3代純合體種子，野生型作為對照，每個株系選取20粒發芽正常、胚根整齊一致的種子，在培養箱中適應培養，選擇6—8片真葉，植株生長一致，長勢良好的幼苗，移栽到直徑為20 cm的花盆中，盆中裝有5 kg土壤（園土∶河沙=4∶1），每盆栽3棵植株。30d后停水進行干旱處理。土壤相對含水率控制在35%—45%。

分別在0d、2d、4d、6d測定各項指標。停止灌水后當天為0d，依次為2d、4d、6d，6d測定完成后開始恢復灌水。

1.2抗性植株的RT-PCR檢測

選T3代轉基因羽衣甘藍和對照，干旱處理后4d，提取總RNA。RT-PCR參照文獻［17］進行。

1.3葉綠素含量測定

取經處理相應時間羽衣甘藍葉，稱0.2g葉片剪碎，浸泡在10 mL 80%（v/v）酒精中，在70℃水浴30 min，在波長649 nm和665 nm使用分光光度計測定吸光度。依據下列公式計算葉綠素a、b的濃度：

Ca=13.95×A665-6.88×A649

Cb=24.96×A649-7.32×A665

兩者的總濃度為葉綠素總含量，通過葉綠素濃度測定葉片葉綠素的含量：

葉綠素含量=（葉綠素濃度×進樣體積×稀釋倍數）/樣品鮮重。

1.4光合參數測定

光合參數采用LI-COR公司生產的LI-6400便攜式光合測量系統測定凈光合速率（Pn），氣孔導度（Gs），蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci），紅/藍光量子通量密度設置為1 100 mol·m-2·s-1，每個數據測量5株，由Pn/Tr和1-Ci/Ca分別表示WUE（水分效率）和Ls（氣孔限制值）。

1.5葉綠素熒光參數測定

把經過處理的植物移入暗處20 min后，對完全伸展、生長部位相同的葉片進行葉綠素熒光測定，使用儀器為葉綠素熒光參數儀。直接讀出PSⅡ的原初光能轉化效率（Fv/Fm）并計算非光化學猝滅系數（NPQ）。

圖1　AtP5CS1基因表達的RT-PCR檢測Fig.1　Assay of AtP5CS1gene expression by RT-PCR

1.6統計分析

采用SPSS 17.0和Excel軟件進行數據處理和統計分析。

2　結果與分析

2.1AtP5CS1表達量的檢測

試驗選用actin作為內參，從圖1可以看出，AtP5CS1基因的mRNA的表達水平在L1株系表達比較高，L2，L3株系表達稍弱，但對照中 AtP5CS1基因的mRNA沒有表達。

2.2轉基因植株與對照葉片葉綠素含量

在干旱脅迫下的植物葉片中葉綠素含量不僅與植物的光合作用直接相關，也是植物耐旱生理指標之一。因此，我們檢測了干旱脅迫下轉基因羽衣甘藍和對照的葉片中葉綠素含量變化。干旱脅迫6d后，轉基因植株葉綠素含量與對照有顯著差異，其中L1的葉綠素含量比對照高36%，其他結果與此類似（圖2）。以上結果顯示，在干旱脅迫下，對照羽衣甘藍葉的葉綠素被破壞，導致葉綠素含量下降，而脅迫天數越長，破壞越嚴重，但轉基因植株受破壞的程度比對照低。復水后葉綠素逐漸恢復，轉基因植株恢復的比對照要快。

2.3轉基因植株與對照葉片光合作用參數

由圖3可知，4個羽衣甘藍株系葉片光合作用參數在干旱脅迫前沒有明顯差異。干旱脅迫2d后轉基因羽衣甘藍凈光合速率（Pn）降低了21.5%，而對照降低了36.5%；轉基因羽衣甘藍氣孔導度（Gs）降低32.4%，而對照降低了66.6%；轉基因羽衣甘藍蒸騰速率（Tr）降低了23.07%，但是對照降低了42.27%；轉基因羽衣甘藍胞間CO2濃度（Ci）降低了8.3%，對照卻降低了38.6%。隨干旱脅迫時間的延長，轉基因植株與對照葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）和水分利用效率（WUE）均顯著降低，但轉基因下降幅度低于對照，有顯著差異（P＜0.05），而氣孔限制值（Ls）相反。脅迫時間達6d時，這些參數與處理前的差異都達到了極顯著水平（P＜0.01）；在恢復供水后，轉基因羽衣甘藍株系L1、L2和L3的Pn和其他參數恢復得較快，而對照的Pn在恢復到第10天時仍然極顯著低于處理前的水平。綜上可知，干旱脅迫對轉基因羽衣甘藍影響顯著小于對照，這與葉綠素含量的結果一致。

圖3　干旱脅迫對轉基因羽衣甘藍葉片光合作用參數的影響Fig.3　Effects ofdroughtstress ondifferent-genotype kale leaves’photosynthetic parameters

2.4轉基因植株與對照葉片熒光參數的變化

從圖4葉綠素熒光參數的變化可以顯示，干旱脅迫顯著降低羽衣甘藍葉片光系統Ⅱ（PSⅡ）的最大光化學效率（Fv/Fm），隨著干旱脅迫延續，PSⅡ反應中心捕獲激發能量效率逐漸下降，但轉基因植株Fv/Fm高于對照，兩者之間有顯著差異（P＜0.05）。供水恢復后，轉基因植株Fv/Fm增長幅度高于對照。

在干旱脅迫后，轉基因和對照的羽衣甘藍葉NPQ（非光化學淬滅系數）均隨著干旱脅迫程度加深明顯增加，對照羽衣甘藍NPQ上升程度明顯高于轉基因羽衣甘藍。干旱脅迫6d后，轉基因羽衣甘藍與對照葉綠素熒光參數的變化存在顯著差異（P＜0.05）；在恢復供水后，葉綠素熒光參數可以恢復，但轉基因株系L1，L2和L3葉綠素熒光參數NPQ低于對照，說明轉基因植株的光合利用效率高于對照。

圖4　干旱脅迫對轉基因羽衣甘藍葉片Fv/Fm和NPQ的影響Fig.4　Effects ofdroughtstress ondifferent-genotype kale leaves’Fv/Fm and NPQ

3　討論

轉基因植物是通過基因改造方法培育的品種。外源基因插入到基因組中是隨機的，位置是不確定的，基因組之間可能存在相互作用。這些能導致活化的基因被沉默或者沉默的基因被激活［18］。由于目前缺乏對植物基因調控和基因相互作用的了解，基因序列被隨機插入到基因組中，大多數的功能是非預期的。對轉基因植物與其等位非轉基因植物的生長發育、化學成分和生理過程進行比較研究，有助于揭示外源基因插入或內源性基因修飾導致非預期潛在的多效性或誘變效應［19］。本研究是對T3代的轉擬南芥AtP5CS1羽衣甘藍與野生型在干旱脅迫下的光合特性進行比較研究，以考查擬南芥AtP5CS1基因插入羽衣甘藍后的功能。

過去研究表明，轉入擬南芥 AtP5CS1基因的轉基因羽衣甘藍植株可以在干旱脅迫下有較好生長特性［17］。前人也在一些植物中獲得高表達P5CS的植物［20］。但在園藝生產過程中，除了要求轉基因羽衣甘藍有較高的耐旱能力外，還應保持較好的光合特征。因此本研究對轉入AtP5CS1基因的羽衣甘藍光合特性進行研究。植物細胞中產生的脯氨酸能保持平衡，而當環境脅迫長期作用于植株，產生的較多的脯氨酸，就會引起脯氨酸的累積，從而使細胞膨壓增加。當轉入外源的P5CS基因，能增加細胞中的脯氨酸含量［21-22］。

光合作用的光化學反應是在類囊體膜上進行的。葉綠素熒光參數的變化可以直接反映PSⅡ的光化學能力。Fo為初始熒光，它表示不參與PSⅡ光化學反應的輻射光能，Fv/Fm表示PSⅡ原初光能轉化效率。Fv與PSⅡ的原初反應過程有關，代表著PSⅡ光化學活性的大?。?1］。干旱脅迫后野生型羽衣甘藍Fv/Fm下降大于轉基因植株（圖3），可能是植物葉片PSⅡ反應中心出現可逆的失活或出現不易逆轉的破壞較多，也可能是植物葉片類囊體膜受到損傷較多。另一方面，干旱脅迫后野生型羽衣甘藍葉綠素含量明顯降低（圖2），也表明干旱脅迫后野生型羽衣甘藍PSⅡ反應中心受到破壞或可逆失活比較嚴重，類囊體膜受損較多。轉基因羽衣甘藍Fv/Fm降低幅度遠遠小于野生型（圖4），說明干旱脅迫對轉基因羽衣甘藍PSⅡ反應中心破壞程度小。

由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅（Non-photochemical quenching，qN或NPQ），非光化學淬滅反映了植物把光能變為熱能的效果。在干旱脅迫下，轉基因羽衣甘藍的NPQ低于對照。換句話說，轉基因羽衣甘藍可以把更多的光能用于光合作用，其光合效率高于對照。

葉片凈光合速率（Pn）是衡量植物葉片光合特性的主要指標，胞間CO2濃度（Ci）是葉片光合作用反應底物，蒸騰速率（Tr）是煙草植株吸收水分和體內養分運輸的動力。干旱脅迫下，野生型羽衣甘藍葉片氣孔導度（Gs）下降，蒸騰速率降低，導致胞間CO2濃度降低，凈光合速率明顯下降，而轉基因羽衣甘藍的降低幅度明顯低于野生型羽衣甘藍。

本試驗研究表明，在干旱和復水條件下，轉基因羽衣甘藍具有較強的耐旱性和相對較高的水分利用效率，可能是因為轉基因羽衣甘藍干旱處理后，脯氨酸含量明顯增加，是對照的2.4倍［17］，大量的脯氨酸的產生，促使植物細胞的滲透勢降低，使植物能從外界環境繼續吸收水分并維持細胞膨壓，使體內各種代謝過程得以順利完成。但是復水時間延長一定程度以后，轉基因羽衣甘藍能否仍然表現出光合優勢，能否在產量上體現優勢，這些問題還需進一步研究。

［1］CONG L L，ZHANG X Q，YANG F Y，et al.Isolation of the P5CSgene from reed canarygrass and its expression undersaltstress［J］.Genetics and Molecular Research：GMR，2014，13：9122-9133.

［2］GREENWAY H，MUNNS R.Mechanisms ofsalt tolerance in nonhalophytes［J］.AnnualReview of Plant Physiology，1980，31：149-190.

［3］RAI A N，PENNAs.Molecular evolution of plant P5CSgene involved in proline biosynthesis［J］.Molecular Biology Reports，2013，40：6429-6435.

［4］王麗珊，林清凡，陳蘭平，等.茶樹P5CS基因克隆及其在滲透和高鹽脅迫下的表達分析［J］.熱帶作物學報，2015，36（1）：68-75.

［5］KUMAR V，SHRIRAM V，KISHOR P K，et al.Enhanced proline accumulation andsaltstress tolerance of transgenic indica rice by overexpressing P5CSF129Agene［J］.Plant Biotechnology Reports，2010，4：37-48.

［6］STRIZHOV N，ABRAHAM E，?KRéSZ L，et al.Differential expression of two P5CSgenes controlling proline accumulationduringsalt-stress requires ABA and is regulated by ABA1，ABI1 and AXR2 in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，1997，12：557-569.

［7］XUE X，LIU A，HUA X.Proline accumulation and transcriptional regulation of proline biothesynthesis anddegradation in Brassica napus［J］. BMB Reports，2009，42：28-34.

［8］FABROg，KOVáCS I，PAVET V，et al.Proline accumulation and AtP5CS2gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17：343-350.

［9］YAMCHI A，JAZII F R，MOUSAVI A，et al.Proline accumulation in transgenic tobacco as a result of expression of Arabidopsis Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase（P5CS）during osmoticstress［J］.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2007，16：9-15.

［10］徐博，任偉，徐安凱，等.轉PuP5CS基因煙草對低溫脅迫的生理響應［J］.華北農學報，2012，27（3）：186-190.

［11］曹麗，義鳴放，孫振元，等.多年生黑麥草P5CS基因的定點突變及其在擬南芥中的轉化［J］.草業學報，2011，20（1）：242-247.

［12］KAVI KISHOR P，ZONGLIE H，MIAOg H，et al.Overexpression of Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiology，1995，108：1387-1394.

［13］HMIDA-SAYARI A，GARGOURI-BOUZID R，BIDANI A，et al.Overexpression of Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase increases proline production and conferssalt tolerance in transgenic potato plants［J］.Plantscience，2005，169：746-752.

［14］SU J，WU R.Stress-induciblesynthesis of proline in transgenic rice confers fastergrowth understress conditions than that with constitutivesynthesis［J］.Plantscience，2004，166：941-948.

［15］支立峰，陳明清，余濤，等.p5cs轉化水稻細胞系的研究［J］.湖北師范學院學報（自然科學版），2005，25（4）：39-43.

［16］VENDRUSCOLO E Cg，SCHUSTER I，PILEGGI M，et al.Stress-inducedsynthesis of proline confers tolerance to waterdeficit in transgenic wheat［J］.Journal of Plant Physiology，2007，164：1367-1376.

［17］李鴻雁，李大紅.轉擬南芥P5CS1基因增強羽衣甘藍的耐旱性［J］.植物生理學報，2014，50（7）：1009-1013.

［18］SMITH N，KILPATRICK J B，WHITELAMg C.Superfluous transgene integration in plants［J］.Critical Reviews in Plantsciences，2001，20：215-249.

［19］NOTEBORN H P，LOMMEN A，VANDER JAGT R C，et al.Chemical fingerprinting for the evaluation of unintendedsecondary metabolic changes in transgenic food crops［J］.Journal of Biotechnology，2000，77：103-114.

［20］AUREKH C，KUMARI K N，ARUNA L，et al.Expression of the Vigna aconitifolia P5CSF129Agene in transgenic pigeonpea enhances proline accumulation andsalt tolerance［J］.Plant Cell Tissue and Organ Culture（PCTOC），2014，116（1）：27-36.

［21］CHEN J B，YANG J W，ZHANG Z Y，et al.Two P5CSgenes from common bean exhibitingdifferent tolerance tosaltstress in transgenic Arabidopsis［J］.Journal ofgenetics，2013，92：461-469.

［22］SZéKELYg，áBRAHáM E，CSéPL A，et al.Duplicated P5CSgenes of Arabidopsis playdistinct roles instress regulation anddevelopmental control of proline biosynthesis［J］.The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2008，53（1）：11-28.

（責任編輯：程智強）

Effects ofdroughtstress on photosynthetic characteristics of kalegenetically modified by AtP5CS1gene of Arabidopsis

LIda-hong1，LI Wei1，SHAO Hai-kuo2
（1Department of Bioengineering，Huanghuai College；2Landscaping Center，Huanghuai College，Zhumadian 463000，China）

Pot experiments with both kalegenetically modified by AtP5CS1gene of Arabidopsis and wild kale（CK）were carried out，and their leaf variations ingas exchange and chlorophyll content and fluorescence parameters werestudied under waterstress for 0d，2d，4d and 6d and rehydration for 2d and 4d.The resultsshowed that with waterstressduration increasing，thegenetically modified kale’s indicatorssuch as chlorophyll content，net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Gs），intercellular CO2concentration（Ci），transpiration rate（Tr），water use efficiency（WUE）and Fv/Fm（maximal efficiency of PSⅡphotochemistry）decreased less than the CK’s，and thegenetically modified kale’sstomatal limitation value（Ls）and nonphotochemical quenching coefficient（NPQ）increased less than the CK’s，indicating that thedamage by waterstress to thegenetically modified kale was less than that to CK；After watering，thegenetically modified kale’s photosynthetic parameters，chlorophyll fluorescence parameters and chlorophyll content recovered rapidly，whereas the CK’s recoveredslowly.Under waterstress thegenetically modified kale could maintaingood photosynthetic characteristics and have agood physiological compensating action after watering，being an important physiological factor for adaptation to arid environments.

Kale；Transgene；Drought resistance；Photosynthetic characteristics；Check experiment

S635.9

A

1000-3924（2016）04-006-05

2015-06-29

李大紅（1969—），男，博士，副教授，主要從事園林植物研究工作。E-mail：lidahong27@163.com