正交試驗法優化稗屬植物　ISSR-PCR反應體系

劉德好，陸永良，婁玉霞，郭水良*（上海師范大學生命與環境科學學院，上海　0034；中國水稻研究所，杭州　30006）

正交試驗法優化稗屬植物ISSR-PCR反應體系

劉德好1，陸永良2，婁玉霞1，郭水良1*
（1上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；2中國水稻研究所，杭州310006）

利用正交設計方法，對稗屬植物ISSR-PCR反應體系的4個因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4個水平上進行優化，建立了稗屬植物ISSR-PCR的最佳反應體系（20μL）：TaqdNA聚合酶0.5 U、引物0.1μmol/L、dNTPs 200μmol/L、DNA模板150 ng。共篩選出9條適合稗屬植物ISSR-PCR的引物，并確定了每條引物的最適退火溫度，可為后續利用ISSR技術開展稗屬植物鑒定和多樣性研究提供技術支持。

稗屬植物；正交設計；ISSR-PCR；反應體系

稗屬（Echinochloa Beauv.）雜草是一種在全球范圍均有分布的惡性雜草，對農作物造成了嚴重的危害。受生態環境、耕作方式等多方面因素的影響，稗屬種內在形態甚至基因上都出現了不同程度的變異，增加了稗屬雜草的分類以及防除的難度［1］。ISSR分子標記技術有相對可靠的穩定性和重復性，具有多態性水平高、DNA用量少和成本低等優點，已廣泛應用于遺傳多樣性分析和種質鑒別等研究［2-3］。

ISSR是一種基于PCR的分子標記技術，不同的反應體系和反應程序會導致不同的結果，為了得到穩定可靠的試驗結果，對ISSR-PCR反應體系進行優化十分必要。本試驗采用正交設計法對稗屬植物ISSRPCR反應體系的4個因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4個水平上進行優化，以期建立稗屬植物最優反應體系，為其遺傳多樣性分析和種質鑒別提供技術依據。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗所用材料為長芒稗（Echinochloa caudata Roshev.），采自福建省三明市尤溪縣新陽鎮大坋村。

1.2試劑

TAKARA LA Taq（Code No.RR02MA），附帶試劑10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+Plus）、dNTPs Mixture （2.5 mmol/L each）。采用哥倫比亞大學設計公布的ISSR引物（http://www.michaelsmith.ubc.ca/services/ NAPS/Primer_Sets/Primers_Oct2006.pdf），由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1DNA的提取和濃度檢測

使用天根植物基因組試劑盒提取長芒稗葉片DNA，利用BeckmandU-640核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。DNA樣品保存于-20℃冰箱中備用，作為PCR擴增的模板。

1.3.2PCR正交試驗的設計

針對酶量、模板DNA、dNTPs及引物4個因素設計4個水平（表1），選用L16（4×4）正交表，設計PCR擴增體系優化的因素-水平正交設計試驗表（表2）。

表　1 正交設計水平因素表Table 1　Factors and levels of orthogonaldesign

表　2 稗屬植物　ISSR-PCR正交試驗設計表　L16（4×4）Table 2　ISSR-PCR reaction of L16（4×4）for Echinochloa

試驗共設16個處理，每個處理重復3次，反應體系20μL，引物選用UBC807。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃復性1 min，35個循環；72℃下延伸10 min后，4℃保存。PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓100 V，電泳50 min。以2 000 bpdNA標準分子量作為分子量標記。使用Tanon 2500凝膠圖像分析系統進行拍照和分析。

1.3.3引物的篩選和退火溫度的確定

由于每個引物的堿基序列不一樣，同一序列在不同物種基因組中出現的頻率也不一致，在合成的100個引物中不是所有的引物都可以擴增出穩定的條帶，擴增出的條帶也不一定具有多樣性，所以在正式試驗前需要對90個引物進行初步的篩選。本試驗選取長芒稗DNA作為模板，用正交試驗所得最佳反應條件對90個引物進行擴增，選取擴增條帶豐富、背景清晰和穩定性好的引物。

退火溫度不僅和引物的序列有關，而且和物種基因組序列有關［4］。同一引物在對不同物種基因組進行擴增時，所需要的最佳退火溫度也是不一致的。因此，適宜的退火溫度對于稗屬植物ISSR擴增反應的結果十分重要。本試驗退火溫度的跨度設置為12℃，由PCR儀自動生成12個溫度梯度。對所篩選出的所有引物逐一進行溫度梯度PCR，以確定每個引物的最佳退火溫度。使用正交試驗得到的最佳反應體系對哥倫比亞大學設計并公布的100條ISSR常用引物進行篩選，并采用溫度梯度PCR模式，設定溫度48—60℃，自動生成12個溫度梯度：48.0℃、48.3℃、49.0℃、50.2℃、51.7℃、53.3℃、54.7℃、56.3℃、57.8℃、59.0℃、59.7℃、60.0℃，逐一確定特異性引物的最適退火溫度。

1.3.4正交試驗結果的極差和方差分析

參照何正文等［5］的方法，依據電泳條帶豐富度、清晰度和背景色深度對16個泳道分別進行賦值：條帶最豐富、主帶清晰以及背景亮度低為最佳，定為16分；與此相反的則評為1分。3次重復試驗獨立評分，合并統計分析。統計同一水平下各因素的分數之和（K1、K2、K3和K4），計算出各因素的極差R。極差一定程度上反應了該因素對整個反應體系的影響程度，極差越大，表明該因素對反應的影響越強烈。

以各因素對4個水平下的3次重復處理的電泳結果（賦值）為基礎，對各因素在4個不同處理水平之間的差異作單因素方差分析。

2　結果與分析

2.1稗屬植物ISSR-PCR反應體系的優化

2.1.1正交試驗結果的對比分析

擴增產物凝膠電泳結果（圖1）表明，處理T4、T6、T7、T12和T13條帶數較多，處理T12和T13主帶明亮、背景清晰。因此，用直接對比法可以推斷出處理T12和T13對于稗屬植物ISSR-PCR擴增結果最好。

圖1　正交試驗　PCR產物電泳圖Fig.1　PCR electrophoresis map of orthogonal tests

2.1.2正交試驗結果的極差分析

正交試驗各因素處理水平和對應處理所得結果的賦值累積分見表3，各因素在4個處理水平下的試驗結果賦值累積總值的極差見表4。16個處理中，累積分值以T12、T13較大，分別為46和47（表3），各因素的極差由大到小分別是dNTPs（85）、引物（57）、Taq酶（43）和DNA模板（36）（表4），即dNTPs對稗屬植物ISSR-PCR反應影響最顯著，引物次之，隨后是Taq酶，模板對反應結果的影響最弱。

表3　正交試驗各因素處理水平和對應處理所得結果的賦值累積分Table 3　Levels of each factor of orthogonal tests and their assignment cumulativescores

表4　dNTPs、引物、Taq酶和模板在4個處理水平下的分別累積分總和及極差Table 4　Total assigned values and range ofdNTPs，primer，TaqdNA polymerase and template of 4 treatment levels

2.1.3各因素對ISSR-PCR擴增影響的方差分析

方差分析同樣表明，dNTPs不同濃度水平對稗屬植物ISSR擴增反應結果的影響最為顯著，引物濃度次之，模板濃度對反應的影響最小（表5）。

圖2直觀地表達了dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA濃度對ISSR-PCR反應的影響，結果表明：dTNPs濃度在200—300μmol/L、引物濃度在0.1μmol/L、Taq酶在1.5 U、模板DNA在150 ng時有最好的擴增結果，對應的處理分別是12和13。

表5　ISSR-PCR正交試驗各因素間的方差分析Table 5　Variance analysis for factors of orthogonal tests of ISSR-PCR

圖2　各因素的不同水平對稗屬植物　ISSR-PCR反應的影響Fig.2　Influence ofdifferent levels of each factor on ISSR-PCR reaction of Echinochloa

2.2稗屬植物ISSR-PCR擴增引物的篩選和退火溫度的確定

本試驗選取長芒稗作為模板，用正交試驗所得最佳反應條件對90個引物進行擴增，選取擴增條帶豐富、背景清晰和穩定性好的引物。經過PCR擴增對90條引物進行篩選后，對篩選出的引物逐一進行溫度梯度PCR，結果發現808、826、827、856、857、888、889、890、891這9條引物有較好的擴增結果（圖3）。對篩選出的9條引物逐一進行溫度梯度PCR，確定每個引物的最佳退火溫度（圖4、表6）。

圖3　篩選引物的PCR產物部分電泳圖Fig.3　Partial electrophoresis map of PCR forscreening primers

圖4　部分引物的溫度梯度　PCR產物電泳圖Fig.4　Electrophoresis map oftemperaturegradient PCR ofsome primers

表6　篩選得到的9個引物及其退火溫度Table 6　Screening of the 9 primers and their annealing temperature for ISSR

3　討論

PCR擴增過程中，當dNTPs濃度過小時，dNTPs在擴增反應結束前消耗殆盡，導致擴增產物量降低；而dNTPs濃度過高又會產生不必要的浪費，而且過多的dNTPs還會和Mg2+結合，降低Mg2+相對濃度，導致LA Taq酶活性降低。根據方差分析結果，在本試驗中，dNTPs對PCR擴增反應的影響最大，這與周凌瑜等［6］的研究結果相似。從圖2A可看出，dNTPs濃度在100—300μmol/L范圍內結果均值隨濃度的增加而增加，在300μmol/L時反應效果最佳，但是方差分析發現，200—300μmol/L范圍內差異不顯著，為了節約成本，把dNTPs的最佳反應濃度定在200μmol/L。

一般PCR擴增反應中，引物濃度通常在0.5μmol/L左右［7］。擴增反應中，引物過少會導致擴增產量不足；而引物過多又會增加非特異的擴增，導致條帶模糊，背景色加深。在本試驗設計濃度范圍內，擴增得到的條帶數隨著引物濃度的增加而降低（圖2B），但是這種差異不顯著，因此將引物濃度定在0.1μmol/L。

本試驗中，Taq酶濃度對稗屬植物ISSR擴增反應結果影響顯著。高濃度的酶會顯著減少擴增的條帶數。當Taq酶濃度為1.5U/（20μL）時，結果均值達到最大9.538（圖2C）。但是Taq酶濃度在0.5—1.5U/（20μL）范圍內對稗屬植物ISSR擴增反應結果無明顯影響，所以Taq酶選擇0.5U/（20μL）。

前人研究表明，模板濃度對擴增反應結果的影響較小，最適擴增反應濃度通常情況下會有一個很大的跨度［8］。本試驗也發現模板濃度在4個水平下的擴增效果沒有明顯差異，只是在150 ng/（20μL）時稍佳（圖2D）。

不同引物有著各自的最佳退火溫度，適宜的退火溫度有利于提高擴增條帶的清晰度、豐富度以及擴增結果的穩定性。

綜上所述，利用正交試驗方法優化稗屬植物ISSR-PCR反應條件，最終確定稗屬植物20μL最佳反應體系：10×buffer 2μL、dNTPs 200μmol/L、Taq酶0.5U、模板150ng、引物0.1μmol/L。反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s、52℃（實際溫度依各引物最佳退火溫度為準）退火30s、72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

［1］National Field Researchgroup.China’s field weeds regionization［J］.J Weedsci，1989，3（2）：1-5.

［2］QIAN W，GEs，HONGd Y.Genetic variation within and alnong populations of a wild rice Oryzagranulata from Chinadetected by RAPD and ISSR markers［J］.Theor APPLgenet，2001，102：440-449.

［3］DEVARUMATH R M，NANDYs，RANI V，et al.RAPD，ISSR and RFLP fingerprintings as useful markers to evaluategenetic integrity of micro propagated plants of threediploid and triploid elite tea clones representing Camelliasinensis（China type）and C.assamicassp［J］.Plant Cell Reports，2002，21：166-173.

［4］ZENG J，ZOU Y P，BAI J Y，et al.Preparation of TotaldNA from“Recalcitrant Plant Taxa”［J］.Acta Botsin，2002，44（6）：694-697.

［5］何正文，劉運生，陳立華，等.正交設計直觀分析法優化PCR條件［J］.湖南醫科大學學報，1998，23（4）：403-404.

［6］周凌瑜，吳晨煒，唐東芹，等.利用正交設計優化小蒼蘭ISSR-PCR反應體系［J］.植物研究，2008，2（4）：402-407.

［7］林萍，張含國，謝運海.正交設計優化落葉松ISSR-PCR反應體系［J］.生物技術，2005，15（5）：34-37.

［8］楊志玲，馮剛利，譚梓峰，等.紅花石蒜ISSR-PCR反應體系的建立［J］.林業科學研究，2006，19（4）：509-512.

（責任編輯：閆其濤）

Optimization of ISSR-PCR reactionsystem of Echinochloa by orthogonaldesign

LIUde-hao1，LU Yong-liang2，LOU Yu-xia1，GUOshui-liang1*
（1College of Life and Environmentsciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China）

By orthogonaldesign，four factors includingdNTPs，TaqdNA polymerase，primers and templatedNA werestudied to establish an optimum ISSR-PCR reactionsystem.The optimum reactionsystem in 20μL contained 0.5 U TaqdNA polymerase，0.1μmol/L primers，200μmol/LdNTPs and 150 ng templatedNA.Nine primers wereselected for Echinochloa ISSR-PCR.Through thegradient PCR test，the optimal annealing temperatures for ISSR-PCR reaction of 9 primers were alsodetermined，respectively.Thissystem provides a technicalsupport for the identification，diversitystudy of Echinochloa.

Echinochloa；Orthogonaldesign；ISSR；PCR reactionsystem

Q78

A

1000-3924（2016）04-017-05

2015-05-19

國家水稻產業體系項目（nycytx-01）“稻田雜草防控技術研究與示范”作者簡介：劉德好（1986—），男，碩士，研究方向為雜草科學

，E-mail：gsg@shnu.edu.cn