水稻半矮稈基因　sd1功能標記的開發與利用

徐建軍，張云輝，顧 嘯，姚麒麟*（上海市松江區農業技術推廣中心，上海　06；江蘇省農業科學院糧食作物研究所，南京　004）

水稻半矮稈基因sd1功能標記的開發與利用

徐建軍1，張云輝2，顧 嘯1，姚麒麟1*
（1上海市松江區農業技術推廣中心，上海201611；2江蘇省農業科學院糧食作物研究所，南京210014）

開發利用已克隆的水稻株高相關基因的分子標記用于分子育種，對水稻理想株型的育種具有十分重要的意義。通過開發水稻半矮稈基因sd1的功能標記，利用該標記對國內外99份水稻品種的sd1基因位點進行了分子檢測，為分子標記輔助選擇育種提供了有利工具。

水稻；sd1；功能標記；分子標記輔助選擇

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有50%以上的人口以稻米為主食。20世紀60年代，在世界范圍內，半矮稈基因sd1的利用使水稻育種發生了革命性變化，水稻產量得到了大幅度提高，被稱為第一次“綠色革命”。爾后，大量的矮稈基因被不斷挖掘利用，給水稻生產帶來了巨大的經濟效益。

在當前的水稻理想株型育種中，株高仍然是備受關注的性狀之一。選育株高適中的水稻品種，一方面能夠優化株型，提高收獲指數，降低秸稈還田的壓力；另一方面能夠提高耐肥性和抗倒能力。目前，在水稻理想株型育種中，應用最廣泛的株高基因仍然是半矮稈基因sd1。sd1基因位于在水稻第1染色體長臂末端。石春海等［1］通過田間性狀調查，結果表明sd1在抑制節間伸長的同時，還可以促進有效穗數、結實率和收獲指數的提高，且不影響抽穗天數、每穗粒數和千粒重。SASAKI等［2］、MONNA等［3］、MADOKA等［4］、SPIELMEYER等［5］從分子水平揭示了sd1水稻株高降低而產量不受影響的原因。

隨著生物技術的發展，分子標記輔助選擇育種為傳統育種注入了新的活力。與傳統育種的單一表型選擇相比，分子標記輔助選擇育種具有快速、準確、不受環境條件影響等優點。開發與sd1基因緊密連鎖或基因內的分子標記，將為水稻株高的改良提供有利工具。截至目前，EUN等［6］、CHO等［7］、OGI等［8］、王松文等［9］開發了一些與sd1基因連鎖的分子標記；但是，sd1基因內標記的開發和應用還未見報道。本研究將開發sd1基因內分子標記，為分子標記輔助選擇育種提供工具。

1　材料與方法

1.1供試材料及水稻DNA的提取

供試材料為來源于國內外的99份水稻品種。其中秈稻11份，粳稻88份；國外28份，國內71份；國外品種主要來自朝鮮、韓國和日本，分別為3份、5份和20份；國內品種主要來源于江蘇、黑龍江、河南、四川等省。在水稻分蘗盛期，剪取新鮮葉片，采用CTAB法提取DNA［10］。

1.2分子標記開發

分子標記開發基于日本晴序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設計InDel分子標記。

1.3分子標記分析

PCR擴增反應采用25μL PCR反應體系：2.5μL模板DNA（1 ng/μL），正反引物各1.25μL （0.1μmol/L），2.5μLdNTPs（0.25 mmol/L），2.5μL 10×Buffer（不含Mg2+），2.5μL 25 mmol/L Mg2+，0.2μL Taq酶（5 U/μL），12.3μLddH2O。

PCR反應程序：95℃預變性5 min，接著94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，33個循環后72℃補充延伸10 min，最后4℃保溫。

PCR擴增產物通過3.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用UVP凝膠成像系統進行成像拍照。

2　結果與分析

2.1sd1基因內分子標記的開發

根據RGP（Ricegenome annotation project）基因注釋，sd1基因在‘日本晴’序列圖譜對應的位置是38381423-38384165 bp（5’-3’）。利用sd1基因的序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站與‘9311’序列進行比對，發現該基因在這2個測序品種之間，存在383 bp的插入缺失。利用該插入缺失，基于‘日本晴’序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設計了1對InDel分子標記。標記命名為：InDel-sd1。標記序列為，F：5’AGCTGGACATGCCCGTGGTC 3’，R：5’TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG 3’。‘日本晴’PCR產物為606 bp，‘9311’的PCR產物為223 bp。

2.2InDel-sd1的分析

以水稻品種‘日本晴’和‘9311’為模板，通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和 UVP凝膠成像系統成像，對分子標記InDel-sd1進行分析，結果如圖1。從圖1可以看出，分子標記InDel-sd1條帶清晰，PCR產物大小準確，為共顯性標記，能夠準確區分‘日本晴’和‘9311’兩個品種sd1基因位點的基因型。前人研究表明‘9311’的sd1基因位點為突變型，隱性半矮稈基因型，‘日本晴’sd1位點為野生型，顯性高稈基因型［11］。所以，本標記能夠準確區分這兩種基因型，為該標記在分子標記輔助選擇育種提供了有力的工具。

2.3InDel-sd1的應用

圖1　InDel-sd1的電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of InDel-sd1

利用分子標記InDel-sd1，對上述99份水稻品種的sd1基因位點進行了基因型分析。結果表明：‘9311’‘南粳35’‘02428’‘關東98’‘明之星’‘九稻3號’‘水原264’‘密陽23’‘當育3號’‘皖稻77’‘川米2號’‘川新糯’‘內中124’等13份水稻品種的sd1基因位點與‘9311’一致，為突變型。其中，粳稻5份，秈稻8份。部分水稻品種的基因型分析結果如圖2。其余86份水稻品種的sd1基因位點為與‘日本晴’一致，為野生型。

3　結論與討論

EUN等［6］、CHO等［7］開發了與sd1基因連鎖的分子標記，并利用它們進行分子標記輔助選擇。OGI等［8］開發了1個與sd1基因緊密連鎖的RFLP標記。王松文等［9］開發了2個基于PCR的sd1基因緊密連鎖的標記，分別于sd1基因的遺傳距離為4.4 cM和9.01 cM。但是，上述開發的標記均為連鎖標記，在實際應用過程中，由于重組事件的發生，可能導致檢測結果的偏差。截至目前，sd1基因內標記的開發和應用還未見報道。本研究基于測序品種‘9311’和‘日本晴’，開發了半矮稈基因sd1的基因內分子標記，為理想株型的分子育種提供了有用工具。本研究開發的基于PCR的基因內分子標記，檢測方法方便快捷，檢測結果準確可靠，比前人開發的連鎖標記更具應用價值。

本研究利用新開發的分子標記，檢測了99份來源于國內外的水稻品種，一方面驗證了新標記的準確性和實用性，另一方面明確了‘9311’等13份水稻品種的sd1基因位點為突變型，為理想株型育種提供了材料基礎。

圖2　22個水稻品種　sd1基因位點的基因型分析Fig.2　Genotype analysis ofsd1gene loci of 22 rice varieties

［1］石春海，申宗坦.水稻半矮稈基因sd1對農藝性狀的影響［J］.中國水稻科學，1996（1）：13-18.

［2］SASAKI A，ASHIKARI M，UEGUCHI-TANAKA M，et al.A mutantgibberellin-synthesisgene in rice［J］.Nature，2002，416：701-702.

［3］MONNA L，KITAZAWA N，YOSHINO R，et al.Positional Cloning of Ricesemidwarfinggene，sd-1：Rice“Green Revolutiongene”Encodes a Mutant Enzyme Involved ingibberellinsynthesis［J］.DNA Research，2002，9（1）：11-17.

［4］MADOKA A，TAKAHIRO K，MIKIKO K，et al.Gibberellin biosynthesis andsignal transduction is essential for internode elongation indeepwater rice［J］.Plant，Cell&Environment，2014，37（10）：2313-2324.

［5］SPIELMEYER W，ELLIS M H，CHANDLER P M.Semidwarf（sd-1），“green revolution”rice，contains adefectivegibberellin 20-oxidasegene ［J］.Proceedings of the National Academy ofsciences，2002，99（13）：9043-9048.

［6］EUN M Y，CHO Yg，CHUNG TY.Molecular markers linked tightly withsemidwarf（sd-1）character andshattering habits in rice［J］.Koreansoc Mol Biol，1991，4：182-185.

［7］CHO Yg.Genetics of esterase isozymes and RFLP markers，and their linkage with asemidwarfgene（sd-1）in rice（Oryzasativa L.）［D］.seoul：Seoul National University，Republic of Korea，1992.

［8］OGI Y，KATO H，MARUYAMA K，et al.Identification of RFLP markers closely linked to thesemidwarfinggene at thesd-1 locus in rice［J］. Japan J Breed，1993，43：141-146.

［9］王松文，施利利，王妮妮，等.水稻sd-1基因分子標記的建立［J］.天津農學院學報，2000，7（2）：52.

［10］PANAUD O，CHEN X，MCCOUCHs R.Development of microsatellite makers and characterization ofsimplesequence length polymorphism （SSLP）in rice（Oryzasativa L.）［J］.Molgengenet，1996，252：597-607.

［11］陳仁霄，張所兵，朱鎮，等.秈稻9311HR-T顯性高稈基因的初步定位［J］.江蘇農業學報，2008，24（5）：553-558.

（責任編輯：張睿）

Development and application of co-segregated marker forsemi-dwarfgenesd1 in rice（Oryzasativa L.）

XU Jian-jun1，ZHANG Yun-hui2，GU Xiao1，YAO Qi-lin1*
（1Songjiang Agricultural Technology and Popularization Center ofshanghai，Shanghai 201611，China；2Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agriculturalsciences，Nanjing 210014，China）

Development and application of molecular markers for cloned plant height relatedgenes is ofgreatsignificance in rice breeding for ideal plant type.A co-segregated functional marker ofsemi-dwarfgenesd1 in rice wasdeveloped，and thesd1 locus of 99 rice varieties at home and abroad wasdetected by the marker.The results provided favorable tools for marker assistedselection breeding in rice.

Rice；sd1；Functional marker；MAS

S511

A

1000-3924（2016）04-022-03

2015-06-08

上海市科技興農“農業種植資源創新與良種良法配套技術集成應用”項目“地方特色品種資源開發應用”課題［滬農科種字（2014）第3-1號］

徐建軍（1983—），男，博士，高級農藝師，研究方向：農業技術推廣。Tel：021-57866226；E-mail：rilitianlang991983@163.com

，Tel：021-67835172；E-mail：sj_yaoqilin@163.com